胰蛋白酶酶解制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌活性肽條件的研究

呂瑜峰，佟永薇，周志江

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609；3.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（ovotransferrin，OVT）是一種易溶的蛋清非結(jié)晶蛋白，約占雞蛋清蛋白重量的12%～13%，分子量為77 kDa～80 kDa[1-2]。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白具廣譜抗菌性，可拮抗許多微生物，包括假單胞菌（Pseudomonas）、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和霍亂弧菌（Vibriocholerae）等致病菌[3-4]，其OTAP-92 片段具抑菌活性，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性，其通過進(jìn)入細(xì)菌的內(nèi)膜從而導(dǎo)致離子選擇性滲透繼而引發(fā)逸散作用[5]達(dá)到抗菌目的；同時也刺激宿主淋巴細(xì)胞自我增殖，達(dá)到抑制致病菌入侵，促進(jìn)機(jī)體免疫力增強(qiáng)[6-7]。

如今，各種來源的抗菌活性肽都已成為研究熱點(diǎn)，活性肽在完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中并沒有生物活性，只在胃腸消化或酶解后，才可發(fā)揮一定的生理作用[8]，其活性功能由肽段的氨基酸種類、排列方式等決定[9]。Tomita 等發(fā)現(xiàn)了牛乳鐵蛋白水解物中所含有的抗菌多肽具有抑菌活性[10]，Haney 等也發(fā)現(xiàn)了牛乳鐵蛋白N 端存在一種陽離子抗菌肽-lactoferrampin[11-13]。抗菌活性肽的來源較廣泛，動物和植物蛋白質(zhì)中均可獲得[14]，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與乳鐵蛋白具有一定的生物同源性，也具有極其相似的生物活性，如抑制形成游離基、鐵的轉(zhuǎn)移、抑菌性等；卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解后也可得到具有抗菌活性的多肽，且活性與其他來源鐵蛋白相似[15-16]?？咕木哂袕V譜抗菌活性，一般來源為哺乳動物的抗菌肽具有廣泛的抗菌譜，除具有抗細(xì)菌、真菌活性外，還具有抗病毒活性，其殺傷作用也對癌細(xì)胞、支原體及螺旋體有用[17]；Ibrahim 等獲得了具抗菌性的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解產(chǎn)物，并初步研究該抗菌活性肽的制備方法[18-21]。目前采用較多地從動植物體中直接分離純化或者應(yīng)用基因工程技術(shù)合成抗菌肽的方法，成本很高，而采用酶解蛋白技術(shù)制備抗菌肽，成本低廉，快速簡便，是獲得抗菌活性肽的最佳途徑之一。OVT 兼具營養(yǎng)性和功能性，易吸收且安全無毒副作用，可作為工業(yè)化的免疫功能因子、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、食品添加劑[22-23]等添加到食品或保健品中，應(yīng)用前景廣泛。

本研究以兩步醇析法從雞蛋蛋清中提取的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白為材料，選擇胰蛋白酶酶解生產(chǎn)抗菌肽，選取大腸桿菌抑菌率為觀察指標(biāo)，設(shè)計正交試驗(yàn)獲得酶解產(chǎn)生抗菌活性肽的最佳條件，為之后的中試研究提供有效的參考工藝。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院生物下游工程實(shí)驗(yàn)室以乙醇沉淀法（已獲專利授權(quán)）獲得的OVT 制品[24-25]；大腸桿菌（E.coli）K12：天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶：Sigma 公司；氯化鈉（分析純）：天津市博迪化工有限公司；蛋白胨（peptone）、酵母粉（yeast extract）、瓊脂粉（agar powder）：Thermo Fisher Scientific 集團(tuán)旗下英國Oxoid 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3-18K 離心機(jī)：德國Sigma 公司；A R1140 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；濾膜（0.22μm）：MILLIPORE 公司；FDU-810 型EYELA 冷凍干燥機(jī)：日本東京理化公司；振蕩培養(yǎng)箱：哈東聯(lián)有限公司；HVE-50 型蒸汽滅菌器：日本哈雅瑪有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺：蘇州安泰有限公司；Biosceen C MBR 自動微生物生長分析儀：IT'S Science Corporation Ltd.，F(xiàn)inland。

1.3 方法

1.3.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解獲取抗菌活性肽條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[26-27]確定主要影響抗菌肽獲得的因素有：溫度、pH 值、底物濃度、酶與底物濃度比、酶解時間5 個因素，結(jié)合實(shí)際情況各因素選取3 個條件，應(yīng)用L18（35）設(shè)計正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計如表1，以酶解產(chǎn)物對大腸桿菌抑菌效果作為評價指標(biāo)，選取最佳酶解條件。

表1 L18（37）因素正交試驗(yàn)設(shè)計表Table 1 L18（37）factor level table

以獲得的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗提物為原料，按表1的條件分別經(jīng)胰蛋白酶酶解，反應(yīng)總體積為5 mL，酶解完成后立即迅速加溫置于80 ℃恒溫水浴下10 min 使酶失活終止酶反應(yīng)，冷卻后4 ℃低速離心30 min 獲得上清液，將上清液冷凍干燥即得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物，-20 ℃冷凍保存。

1.3.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物抑菌率的測定

1.3.2.1 大腸桿菌cfu-OD600曲線的繪制

根據(jù)平板菌落計數(shù)法[28-29]，無菌條件下將1 mL 已用無菌生理鹽水（0.9%）稀釋的大腸桿菌菌液倒入已倒好的固體LB 培養(yǎng)基[胰蛋白胨（tryptone）10 g/L、酵母提取物（yeast extract）5 g/L、氯化鈉（NaCl）10 g/L，調(diào)節(jié)pH 達(dá)到7.2～7.4]平板中進(jìn)行涂布均勻，待基本滲透完全，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，記錄每小時菌落數(shù)，計算相應(yīng)菌液濃度（cfu 值），同時測定菌懸液OD600nm值，平行3 次后，繪制cfu-OD600標(biāo)準(zhǔn)曲線[單位體積菌懸液所形成的菌落數(shù)（cfu 值）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度菌懸液OD600nm值為縱坐標(biāo)]。

1.3.2.2 大腸桿菌生長曲線測定

1）無菌條件下將斜面保藏的大腸桿菌轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)瓊脂斜面37 ℃下活化（培養(yǎng)24 h）2 次。

2）挑取活化后的大腸桿菌接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)為菌懸液。

3）以107cfu/mL 濃度接種2）中培養(yǎng)的菌懸液至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)板（Bioscreen C 儀器專用）中，設(shè)定溫度37 ℃，中速振蕩（120 r/min），波長600 nm，使用Bioscreen C 自動微生物生長分析儀測定大腸桿菌生長曲線（時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)）。

1.3.2.3 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌肽對大腸桿菌的影響

首先，分別用無菌水配制正交試驗(yàn)獲得的18 個凍干樣品成3 mL 液體樣品，以0.22 μm 膜過濾除菌；之后取1 mL 上述液體樣品加入8 mL 已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，再加入1 mL 已活化并稀釋至107cfu/mL 的大腸桿菌菌液，混勻備用。陽性對照以無菌水替代抗菌肽樣品（加入氨芐青霉素濃度為50 μg/mL），設(shè)生理鹽水為陰性對照，取上述混勻液400 μL 加入已設(shè)定好的蜂窩板（Bioscreen C 儀器專用）孔中，每個樣品重復(fù)3 個孔樣，設(shè)定溫度37 ℃、培養(yǎng)時間32 h（設(shè)備提前預(yù)熱半小時）、波長600 nm，使用Bioscreen C 自動微生物生長分析儀測定卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物對大腸桿菌生長的影響。

2 結(jié)果分析

2.1 大腸桿菌生長曲線和菌落數(shù)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線（cfu-OD600）

根據(jù)1.3.2.1 述試驗(yàn)方法操作，得到cfu-OD600標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 大腸桿菌菌落數(shù)與吸光度關(guān)系圖Fig.1 The diagram between the number of E.coli and the absorbance

圖1中，吸光度值與大腸桿菌濃度呈線性關(guān)系，方程為y=0.072 8x+0.005 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.989。

根據(jù)1.3.2.2 述試驗(yàn)方法操作，將活化后大腸桿菌菌懸液接種于LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)板，以液體培養(yǎng)基為對照，設(shè)定600 nm 檢測波長，使用全自動生長曲線測定儀測定大腸桿菌生長曲線，得到相應(yīng)時間段的OD600值，分析數(shù)據(jù)得出大腸桿菌生長曲線如圖2。

由圖2中大腸桿菌生長曲線可以看出大腸桿菌的生長情況，0～1.5 h 之間為延遲期，在2.5 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，生長速率逐漸增大，17 h 后生長速率逐漸減小，17 h～26 h 吸光度基本維持穩(wěn)定進(jìn)入穩(wěn)定期，之后就逐步進(jìn)入衰減期。因此研究中討論抗菌肽對大腸桿菌生長抑制作用選取大腸菌群進(jìn)入生長穩(wěn)定期后的抑制情況進(jìn)行分析，主要選擇0～20 h 之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖2 大腸桿菌生長情況Fig.2 The growth curve of E.coli

2.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物抑菌性研究

根據(jù)1.3.2.3 的試驗(yàn)設(shè)計，檢測大腸桿菌對數(shù)生長期菌液濃度，分析卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌活性肽的抑菌情況，獲得各組卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌肽在20 h 時對大腸桿菌生長抑制作用的數(shù)據(jù)，計算獲得各組的抑菌率見表2。

其中試驗(yàn)E3、E5、E11、E15 條件下獲得的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物可以看出明顯抑制大腸桿菌生長的作用，其他試驗(yàn)條件下得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物對大腸桿菌的作用及其微弱。抑菌率較高的試驗(yàn)組從大到小依次為E15，E3，E11，E5，E10。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results and range analysis

表2中各試驗(yàn)組的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌肽終濃度見表3。

表3 不同試驗(yàn)條件下得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物濃度Table 3 The concentration of antimicrobial peptide under different experimental conditions

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌肽的抑菌率與試驗(yàn)組獲得的抗菌肽終濃度密切相關(guān)，其中E5、E15 試驗(yàn)條件下獲得的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌肽含量最高；E16、E17、E4、E3含量次高，但較E5，E15 含量下降非常明顯。E15 條件下獲得的抗菌肽濃度較高，為10.47 mg/mL，說明此條件得到的酶解物成份對大腸桿菌抑菌效果較好。

詳細(xì)考察比較上述5 個（E15、E3、E11、E5、E10）高抑菌率試驗(yàn)組卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗菌肽隨時間對大腸桿菌的抑制作用情況見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)時間卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解物對大腸桿菌生長的影響Fig.3 Effects of ovotransferrin hydrolysates on the growth of E.coli at different culture time

由圖3可以看出，隨著大腸桿菌培養(yǎng)時間不斷增加，抑菌率也漸漸增大，隨后逐步趨于穩(wěn)定，E15 試驗(yàn)條件獲得的抗菌肽在培養(yǎng)17 h 即可到達(dá)抑菌高峰，為87.18%，其他條件獲得的酶解物到達(dá)抑菌最強(qiáng)效果時間較E15 延后，E15 試驗(yàn)條件獲得的抗菌肽不但抗菌作用迅速而且抗菌效果強(qiáng)。

由表2數(shù)據(jù)分析可以得到抑菌率最優(yōu)組合為pH 值8.5，溫度55 ℃，底物濃度30 mg/mL，酶底比1∶300（U/mg），酶解1.5 h；另外，從極差分析還可以看出，pH 值對抑菌率的影響最大。

為進(jìn)一步分析各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis

由表4可知：pH 值、底物濃度、酶與底物比對試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，其中pH 值、底物濃度極其顯著（P＜0.01）。

3 討論

目前抗菌肽的具體抗菌機(jī)制還在研究中，雖然種類繁多的抗菌肽在組成結(jié)構(gòu)上或構(gòu)象上有所不同，但抗菌活性都較明顯，其主要作用在細(xì)胞膜磷脂雙分子層，脂質(zhì)雙分子層表面是帶有負(fù)電荷的，與肽段上帶有的正電荷相互作用形成膜通道，致使細(xì)胞內(nèi)容物外流，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞凋亡。文中試驗(yàn)采用的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗菌活性肽混合物樣品是通過胰蛋白酶酶解OVT 獲得的，之后為更好的進(jìn)行機(jī)制研究可以考慮進(jìn)一步采用超濾的方法進(jìn)行初步分離，截留分子量較小的肽段，同時將沒有水解的大蛋白及雜質(zhì)除去，隨后再用柱層析進(jìn)行初步分離純化獲得純度較高的抗菌肽樣品，并研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組織構(gòu)象。

禽蛋作為來源充足的大宗食品，可以成為抗菌肽的良好來源，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抗菌活性肽作為一種安全的、新型的抗生素替代物、天然的防腐劑可以廣泛的在食品行業(yè)、化妝品行業(yè)中得到應(yīng)用，從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中酶解獲得抗菌肽無毒、易吸收且高效。跟隨生物技術(shù)特別是蛋白質(zhì)工程和酶工程的不斷發(fā)展，將會有更多品類的抗菌肽得以開發(fā)利用，用以替代耐藥性的抗生素類藥物，也將為禽蛋的深度開發(fā)提供思路和方向。

4 結(jié)論

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白通過胰蛋白酶酶解獲得抗菌肽通過正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得最佳條件為：pH 值8.5，溫度55 ℃，底物濃度30 mg/mL，酶與底物濃度比1∶300（U/mg），酶解時間1.5 h，該抗菌肽經(jīng)試驗(yàn)測得最大抑菌率達(dá)到89.152%。