大腸癌組織中VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)及淋巴管生成的相關(guān)性研究

朱建洲，于 農(nóng)，劉 芳

(蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州 215129)

隨著人們生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國大腸癌的發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[1]。目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移是影響大腸癌患者預(yù)后的一個(gè)主要因素，淋巴管可作為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的主要通道，腫瘤微轉(zhuǎn)移，特別是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移逐漸受到臨床重視[2-3]。隨著現(xiàn)代生物學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，最新研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)及其受體VEGFR-3的表達(dá)與淋巴管的生成密切相關(guān)，探討VEGF-D、VEGFR-3與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，研究影響大腸癌淋巴管生成及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對大腸癌臨床分析、預(yù)后判斷以及抗癌方法的制定都有著重要的意義[4-5]。因此本次研究特選取本院大腸癌患者83例，分別取其癌標(biāo)本和癌旁大腸組織，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2014年8月至2016年8月收治的大腸癌患者83例，其中男58例，女25例，年齡47～79歲，平均(63.17±14.68)歲；結(jié)腸癌39例，直腸癌46例；腫瘤直徑為1～12 cm，平均(6.57±4.29)cm；潰瘍性生長37例，浸潤型生長33例，腫塊型生長13例；高分化17例，中分化47例，低分化19例；根據(jù)Dukes分期：A期19例，B期21例，C期32例，D期11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)腸鏡檢查確診為大腸癌；(2)無消化性潰瘍以及胃腸道手術(shù)病史；(3)手術(shù)前均未進(jìn)行任何治療；(4)患者對本次研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前進(jìn)行過化療治療者；(2)不適宜進(jìn)行手術(shù)者。

1.2方法 每例大腸標(biāo)本取大腸癌組織及距離癌腫邊緣5 cm，經(jīng)病理證實(shí)無癌細(xì)胞殘存的正常腸組織1塊，所有標(biāo)本在腫瘤切下后1 h內(nèi)置于液氮中保存。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)與免疫組化法對大腸癌組織和正常組織中的VEGF-D、VEGFR-3的表達(dá)進(jìn)行檢測，VEGF-D、VEGFR-3抗體均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。(1)流式細(xì)胞檢測：選取待測的新鮮組織約30 g，用剪刀將組織剪碎，用鑷子將組織物在120目銹鋼網(wǎng)上輕輕搓動(dòng)，收集搓完后組織，制成1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞原液，取出1 mL原液分別加入VEGF-D、VEGFR-3抗體，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。(2)免疫組化法：根據(jù)試劑盒說明滴加一抗VEGF-D、VEGFR-3和生物素化二抗及試劑SABC，用DBA顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片待檢。每張切片觀察10個(gè)高倍視野，以細(xì)胞中有棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景非特異性著色為陽性細(xì)胞。

1.3觀察指標(biāo) (1)采用美國BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀測定VEGF-D、VEGFR-3水平，以熒光指數(shù)(FI)表達(dá)VEGF-D、VEGFR-3的相對含量，計(jì)算公式：FI=蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度-對照樣品平均熒光強(qiáng)度/正常對照樣品平均熒光強(qiáng)度。(2)微血管計(jì)數(shù)在盲法下進(jìn)行，每張切片由兩名病理醫(yī)師分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，微血管密度(MVD)的計(jì)數(shù)根據(jù)淋巴管淋巴管內(nèi)透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)、同源異型核轉(zhuǎn)錄因子(Prox-1)染色結(jié)果判斷，LYVE-1、Prox-1陽性的管腔視為淋巴管，先于低倍鏡(40倍和100倍)下確定3個(gè)脈管著色最為密集的區(qū)域，然后改為200倍視野下計(jì)數(shù)淋巴管或微血管數(shù)目，每例計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其均值作為該病例的微淋巴管密度和微血管密度。正常大腸組織選擇陽性染色脈管最豐富的區(qū)域，在200倍視野下分別計(jì)算淋巴管和微血管數(shù)目，計(jì)數(shù)5個(gè)視野，最后取其均值。LYVE-1、Prox-1的檢測分別應(yīng)用山羊抗人LYVE-1單克隆抗體和山羊抗人Prox-1單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié) 果

2.1VEGF-D、VEGFR-3在大腸癌、正常腸組織中的表達(dá) 大腸癌組織中VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)水平較正常大腸黏膜組織顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 VEGF-D、VEGFR-3在大腸癌、正常腸組織中的表達(dá)

表2 VEGF-D、VEGFR-3的表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2VEGF-D、VEGFR-3的表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤直徑<3 cm的大腸癌患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于腫瘤直徑≥3 cm的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；浸潤深度未及漿膜患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于浸潤漿膜及以外患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Dukes分期為A+B期患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于C+D期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3微淋巴管密度與VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的關(guān)系 VEGF-D、VEGFR-3蛋白表達(dá)陽性標(biāo)本其癌旁微淋巴管密度較陰性標(biāo)本均顯著較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 微淋巴管密度與VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

近年來，我國大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害著人們的生命健康。浸潤與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特性，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)，淋巴轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要途徑[6-7]。正常的大腸組織的毛細(xì)血管管腔較小，且數(shù)量較少，而惡性腫瘤周邊的淋巴管密度會(huì)顯著增加，淋巴轉(zhuǎn)移提示著腫瘤的發(fā)展，而淋巴管腔的生成是受淋巴管生成因子以及其受體介導(dǎo)和調(diào)控的，對淋巴管生成因子及其受體的表達(dá)進(jìn)行探究，對大腸癌患者預(yù)后的判斷有著重要意義[8-9]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是內(nèi)皮細(xì)胞中具有特異性的有絲分裂原，具有明顯的促進(jìn)某些內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的作用，特別是促進(jìn)血管的生成[10]。VEGF-D屬于VEGF，是一種重要的淋巴管生成因子，可以作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上與其受體VEGFR-3結(jié)合并激活，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和淋巴管的生成，調(diào)控血管以及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的新生，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用[11-12]。VEGFR-3是一種受體絡(luò)氨酸激酶，廣泛分布于早期的胚胎血管內(nèi)細(xì)胞上，在胚胎發(fā)育后期以及正常的成體中，VEGFR-3只特異性表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，處于相對靜止的狀態(tài)，而一旦機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)或有腫瘤生成，VEGFR-3便會(huì)再次被激活與其配體結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移[13-14]。

趙云霞等[15]研究者認(rèn)為，在惡性腫瘤組織中VEGF-D的表達(dá)誘導(dǎo)會(huì)使VEGFR-3水平上升，并激發(fā)VEGFR-3活化，活化后的VEGFR-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)促使淋巴管生成，導(dǎo)致癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)水平較正常大腸黏膜組織顯著較高，這說明VEGF-D的高表達(dá)與大腸癌的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)，VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的升高能反應(yīng)腫瘤預(yù)后情況，能繼續(xù)促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮的生長。腫瘤直徑<3 cm的大腸癌患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于腫瘤直徑≥3 cm的患者，浸潤深度未及漿膜患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于浸潤漿膜及以外患者，Dukes分期為A+B期患者VEGF-D、VEGFR-3水平均顯著低于C+D期患者，VEGF-D、VEGFR-3的表達(dá)能反應(yīng)大腸癌臨床病理特征，提示VEGF-D、VEGFR-3參與到了腫瘤的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移。VEGF-D與VEGFR-3相結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)以及腫瘤周邊淋巴管的增生，淋巴管的表面積以及通透性增加，趨化腫瘤細(xì)胞進(jìn)入到淋巴管內(nèi)，腫瘤細(xì)胞通過間質(zhì)液流動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)至淋巴管中，最終發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移[16-17]。VEGF-D、VEGFR-3蛋白表達(dá)陽性標(biāo)本其癌旁微淋巴管密度較陰性標(biāo)本均顯著較高，VEGFR-3與VEGF-D結(jié)合后發(fā)生磷酸化，使多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，淋巴內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖分化，新生的淋巴管尚且缺乏連續(xù)的基底膜，內(nèi)皮細(xì)胞間的連接較為疏松，且間隙較大，而腫瘤內(nèi)的淋巴管較為密集，隨著腫瘤的生長，瘤間質(zhì)滲出物的增加，逐漸向周圍毛細(xì)淋巴管擴(kuò)張，因此腫瘤周邊的淋巴管密度較正常組織更為密集。

4 結(jié) 論

在大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF-D、VEGFR-3發(fā)揮了一定作用。大腸癌中VEGF-D、VEGFR-3可能與腫瘤周邊淋巴管生成相關(guān)，其表達(dá)上升誘導(dǎo)淋巴管生成?？蓪EGF-D、VEGFR-3作為評(píng)估大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤能力的輔助指標(biāo)。