云南4種罕見(jiàn)異常血紅蛋白突變型分析*

何建萍，郭薇霞，唐 健，羅勝軍，呂夢(mèng)欣，黨峰博，林克勤，楊昭慶△

(1.昆明市婦幼保健院遺傳室,云南昆明 650031；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室,云南昆明 650118)

血紅蛋白病是由于珠蛋白基因突變導(dǎo)致血紅蛋白結(jié)構(gòu)或合成量異常的最常見(jiàn)的遺傳病，包括異常血紅蛋白病和地中海貧血兩大類[1]。該病分布廣泛，全世界約有7%的人群攜帶血紅蛋白病基因[2]。目前人類血紅蛋白變異體數(shù)據(jù)庫(kù)HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)收錄的血紅蛋白突變已經(jīng)超過(guò)了1 300多種,我國(guó)報(bào)道的已經(jīng)超過(guò)80余種。早期我國(guó)大范圍血紅蛋白病調(diào)查結(jié)果都顯示我國(guó)異常血紅蛋白分布以云南發(fā)生率最高，達(dá)到了6.06%和5.9%[3-4]。目前云南異常血紅蛋白報(bào)道較多的是以產(chǎn)生異常條帶E為主的β珠蛋白基因突變HbE(G>A)[5]。本研究通過(guò)對(duì)7例毛細(xì)管電泳檢出的罕見(jiàn)異常血紅蛋白條帶(F、K、J、D)進(jìn)行分析，確定其突變的基因分子基礎(chǔ)，初步探討罕見(jiàn)基因型與表型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 獲取到云南省昆明市婦幼保健院進(jìn)行地中海貧血產(chǎn)前篩查時(shí)血紅蛋白毛細(xì)管電泳檢出異常血紅蛋白條帶的女性7例。

1.2方法

1.2.1血液學(xué)檢查 取乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝靜脈血2 mL，采用日本sysmex XT-2000i血細(xì)胞分析儀檢測(cè)各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)。血紅蛋白電泳采用歐洲helena V8全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2常見(jiàn)地中海貧血突變基因檢測(cè) 采用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)23種中國(guó)人常見(jiàn)的地中海貧血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用試劑為亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供的地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒。

1.2.3α和β珠蛋白基因片段擴(kuò)增 采用QIAGEN公司提供的全血試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取DNA樣本進(jìn)行PCR，擴(kuò)增包含啟動(dòng)子序列及3個(gè)外顯子在內(nèi)的α、β珠蛋白基因序列。引物序列參照文獻(xiàn)[6]，PCR擴(kuò)增采用TaKaRa LA Taq高保真酶，儀器采用美國(guó)ABI公司的9700PCR擴(kuò)增儀。HBA1、HBA2、HBB基因PCR擴(kuò)增體系均為30 μL:每一反應(yīng)體系含2×Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量約100 ng。反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸20 min。

1.2.4α和β珠蛋白基因片段測(cè)序 純化PCR產(chǎn)物后，使用ABI3700測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 7例樣本血常規(guī)參數(shù)均為正細(xì)胞正色素，無(wú)明顯異常。見(jiàn)表1。

表1 4種罕見(jiàn)異常血紅蛋白突變型血液學(xué)參數(shù)特征

2.2血紅蛋白電泳結(jié)果 7例標(biāo)本共檢出4種異常血紅蛋白電泳條帶：分別為F、K、J、D帶，占總血紅蛋白的含量范圍從38.32%到61.37%。其中代表性的含量異常升高的F帶見(jiàn)圖1。

圖1 Hb San Bruno電泳結(jié)果圖(Hb F含量升高)

2.3基因型檢測(cè)結(jié)果 α和β珠蛋白序列分析檢出4種異常血紅蛋白突變型：1例F帶為Hb San Bruno(HBB:c.120G>C)、2例K帶為Hb New York(HBB:c.341T>A)、2例J帶為Hb J-Bangkok(HBB:c.170G>A)、2例D帶為Hb G-Coushatta(HBB:c.68A>C)。7例異常血紅蛋白均未檢出α、β地中海貧血基因突變。見(jiàn)圖2。

圖2 Hb San Bruno測(cè)序結(jié)果圖(β珠蛋白基因CD39CAG->CAC雜合突變) ，箭頭示突變

3 討 論

我國(guó)異常血紅蛋白分布和發(fā)生率具有明顯的遺傳多態(tài)性，在我國(guó)南方如廣東、廣西地區(qū)已報(bào)道過(guò)Hb Q-Tailand、Hb New York、Hb G-Chinese等多種突變種類[6]。本研究對(duì)來(lái)本院進(jìn)行地中海貧血篩查時(shí)血紅蛋白電泳檢出異常條帶的7例女性樣本進(jìn)行了回顧性分析，通過(guò)基因檢測(cè)確診了4種血紅蛋白的罕見(jiàn)突變，進(jìn)一步豐富了云南的異常血紅蛋白突變譜。

本研究檢出了1例Hb San Bruno罕見(jiàn)突變。它是β珠蛋白第39位密碼子谷氨酰胺(CAG)突變?yōu)榻M氨酸(CAC)的雜合突變，該突變能產(chǎn)生相對(duì)穩(wěn)定的血紅蛋白。這一突變于2002年HOYER在非洲裔美國(guó)女性中首次發(fā)現(xiàn)[7]，此后未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,這是第二例報(bào)道，也是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)該突變，提示該突變?cè)诓煌N族之間都有分布。本次檢出的這一例Hb San Bruno除了產(chǎn)生占總血紅蛋白含量39%的異常F帶，其他血液學(xué)參數(shù)無(wú)明顯異常，這與美國(guó)報(bào)道的攜帶者呈小細(xì)胞低色素貧血不相符，但是美國(guó)的攜帶者呈小細(xì)胞低色素貧血是由于該攜帶者合并了子宮肌瘤造成的。研究進(jìn)一步支持了該突變不會(huì)產(chǎn)生臨床表現(xiàn)這一結(jié)論。本研究還檢出了2例Hb New York和2例Hb J-Bangkok，分別產(chǎn)生異常K帶與J帶，這與廣西和廣東報(bào)道的我國(guó)南方常見(jiàn)異常血紅蛋白種類和特點(diǎn)相符[8-9]。此外，本研究檢出了2例Hb G-Coushatta，ZHANG等[10]2017年的時(shí)候在566例云南β珠蛋白突變攜帶者中也曾檢出1例，而既往報(bào)道顯示Hb G-Coushatta分布以北方人群為主[4]，但近年來(lái)，在廣東[11]和江蘇無(wú)錫[12]等南方地區(qū)都有檢出，提示Hb G-Coushatta在南方人群中也有分布。

本研究檢出的Hb San Bruno、Hb New York、Hb J-Bangkok和HbG-Coushatta血紅蛋白電泳分別產(chǎn)生異常的F帶、K帶、J帶和D帶，其他血液學(xué)參數(shù)均無(wú)明顯異常。這是由于大多數(shù)異常血紅蛋白是由于血紅蛋白分子外部氨基酸發(fā)生替代突變，這類替代絕大多數(shù)不影響血紅蛋白分子的穩(wěn)定性和功能，因此突變攜帶者通常無(wú)臨床表現(xiàn)[13]。盡管本研究檢出的四種罕見(jiàn)突變都不產(chǎn)生臨床表現(xiàn)，但是云南作為異常血紅蛋白發(fā)生率最高的地區(qū)，曾報(bào)道過(guò)罕見(jiàn)的血紅蛋白突變型Hb Rush(HBB:c.304G>C)[14]，該突變會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定的血紅蛋白，能導(dǎo)致溶血性貧血的臨床癥狀，因此在血紅蛋白電泳篩查出異常條帶后，有必要對(duì)異常血紅蛋白病進(jìn)行基因檢測(cè)確診。另一方面，云南是除廣州、廣西外的地中海貧血高發(fā)地區(qū)，α地中海貧血發(fā)病率3.18%～9.46%，β地中海貧血發(fā)病率1.6%～3.56%[15]，因此這些罕見(jiàn)突變有較高的概率合并地中海貧血，有可能產(chǎn)生更嚴(yán)重的血液學(xué)表型。有研究報(bào)道其他罕見(jiàn)突變類型Hb Gran Via、Hb Macarena和Hb EI Retiro合并α地中海貧血會(huì)產(chǎn)生血紅蛋白H病，導(dǎo)致中到重度的溶血性貧血[16]。因此，在云南這樣容易產(chǎn)生異常血紅蛋白和地中海貧血雙重雜合子的地區(qū)，當(dāng)血紅蛋白毛細(xì)管電泳檢出異常條帶時(shí)，有必要對(duì)異常血紅蛋白突變進(jìn)行基因檢測(cè)，積累數(shù)據(jù)明確其臨床表型和危害性，從而更好地指導(dǎo)遺傳咨詢。

由于異常血紅蛋白病絕大多數(shù)無(wú)臨床表現(xiàn)，因此往往不能引起人們的重視。但是這些異常血紅蛋白的存在會(huì)對(duì)糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測(cè)結(jié)果造成干擾[17]。HbA1c是評(píng)價(jià)糖尿病患者長(zhǎng)期血糖控制水平及糖尿病并發(fā)癥的重要指標(biāo)，研究表明利用高效液相色譜法檢測(cè)時(shí)，Hb J-Bangkok會(huì)使HbA1c水平假性降低[18]，而Hb New York會(huì)使HbA1c水平假性升高[19]，此時(shí)檢測(cè)出的HbA1c不能反映患者近2～3個(gè)月的血糖控制水平。因此，在像云南這樣異常血紅蛋白發(fā)生率高的地區(qū)，在應(yīng)用HbA1c評(píng)估糖尿病患者血糖控制狀況時(shí)，應(yīng)先了解患者的血紅蛋白情況，排除因血紅蛋白變異體存在而導(dǎo)致HbA1c臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

本研究報(bào)道了中國(guó)首例Hb San Bruno罕見(jiàn)異常血紅蛋白突變型，進(jìn)一步豐富了我國(guó)異常血紅蛋白種類。通過(guò)對(duì)基因型和表型進(jìn)行探討，絕大多數(shù)異常血紅蛋白突變攜帶者沒(méi)有任何臨床癥狀，但由于云南是地貧高發(fā)區(qū)，其合并地中海貧血的臨床意義和危害性還有待于進(jìn)一步研究。