基于分子條形碼標(biāo)記的超深度二代測序技術(shù)在兒童急性白血病微小殘留病檢測中的應(yīng)用*

王明敏，肖劍文，雷小英，楊 山

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤中心，重慶 400014；2.重慶兒童醫(yī)院兒科研究所，重慶 400014；3.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014；4.兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014；5.重慶市萬盛開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院兒科，重慶 400800)

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2018年11月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科收治AL患兒35例。其中男性24例，女性11例，平均年齡(82.31±8.86)個月。所有患兒診斷時年齡均<18歲，且按照WHO-2016造血與淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[5]完善檢查確診為AL。Burkitt白血病、繼發(fā)性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、既往接受過抗白血病治療、合并其它腫瘤性疾病及未能完成誘導(dǎo)緩解療程患兒未納入本研究。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1治療方法 35例患兒中包括前體B-ALL(BP-ALL)22例、T-ALL 4例、AML 6例和MPAL 3例，MPAL均為B-ALL與AML雙系列型?；純壕邮芤粋€療程誘導(dǎo)治療并達(dá)到完全緩解(CR)：ALL及MPAL按照改良的St.Jude Total-XV-ALL方案[6]化療，AML按照COG-AML方案[7]化療。CR定義為[6-7]：1個療程化療結(jié)束，骨髓抑制解除，(1)臨床上無明顯出血、感染及白血病浸潤表現(xiàn)；(2)血常規(guī)血紅蛋白>90 g/L，血小板>100×109/L，白細(xì)胞正常或減低，分類無幼稚細(xì)胞；(3)骨髓細(xì)胞學(xué)提示增生活躍或明顯活躍，且白血病細(xì)胞<5%。采集患兒初診及誘導(dǎo)治療結(jié)束后骨髓液進(jìn)行檢測，采集患兒父母外周血作為WES測序?qū)φ諛颖?，若無法獲取患兒父母樣本則選擇誘導(dǎo)治療結(jié)束后患兒口腔黏膜刮片細(xì)胞作為對照樣本。

1.2.2FCM-MRD檢測 診斷時采集患兒EDTA抗凝骨髓液，利用8色流式細(xì)胞儀確定ALL、AML及MPAL患兒白血病相關(guān)免疫表型(LAIP)[8-9]。未能發(fā)現(xiàn)LAIP標(biāo)記則均應(yīng)用以下簡易抗體組合[8-9]：B-ALL：CD19、CD10及CD3；T-ALL：CyCD3及TdT；AML：CD34、CD117、CD33、CD38、CD19、CD56、CD64、CD14及HLA-DR等。

誘導(dǎo)結(jié)束后，采集EDTA抗凝骨髓液2 mL并分離單個核細(xì)胞(MNC)，根據(jù)初治時LAIP選擇個體化檢測抗體組合或利用簡易組合，使用流式細(xì)胞儀檢測FCM-MRD。出現(xiàn)下述情況則定義為FCM-MRD陽性[8-9]：正常表達(dá)的抗原強(qiáng)度發(fā)生改變(增強(qiáng)或減弱)和/或丟失、異常表達(dá)其他系別標(biāo)志、早期和晚期抗原同時表達(dá)、幼稚細(xì)胞明顯增多且均質(zhì)性表達(dá)等。以這些殘存細(xì)胞占骨髓MNC總數(shù)比例作為MRD數(shù)值。ALL和AML分別以FCM-MRD<10-4和FCM-MRD<10-3為陰性[3,9]，MPAL分別記錄ALL及AML細(xì)胞群FCM-MRD水平。

1.2.3PCR-MRD檢測 診斷時采集患兒EDTA抗凝骨髓液，采用多重巢式RT-PCR(mutiplex RT-PCR)技術(shù)行29種白血病融合基因篩查[10]。ETV6/RUNX1、BCR/ABL、TCF3/PBX1、RUNX1/RUNXT1及CBFb/MYH11等常見基因陽性者采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測標(biāo)本基因拷貝數(shù)、已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品濃度，利用待測標(biāo)本ABL濃度作為對照，得出待測標(biāo)本基因拷貝數(shù)、基因拷貝數(shù)與ABL濃度比值[11]；MLL重排、SIL/TAL等少見基因陽性者則采用RT-PCR技術(shù)復(fù)核[11]。

融合基因陽性患兒誘導(dǎo)結(jié)束后，采集EDTA抗凝骨髓液分離MNC并提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。上述常見融合基因采用qRT-PCR技術(shù)定量檢測，基因拷貝數(shù)<10-4為PCR-MRD陰性[3]；少見融合基因陽性者采用RT-PCR技術(shù)定性檢測，未見陽性條帶為PCR-MRD陰性[3]。

1.2.4WES、標(biāo)記選擇及NGS-MRD檢測 采集患兒診斷時EDTA抗凝骨髓液并收集對照樣本，使用QIAamp DNA Blood MiniKit(Qiagen)試劑盒提取基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分光光度計進(jìn)行基因組DNA定量檢測，OD260/OD280值1.6～1.8為合格樣本，-20 ℃保存。

當(dāng)然，今天的我們都知道了，美國與其他一些西方發(fā)達(dá)國家雖然確實也曾遭遇環(huán)境保護(hù)方面的一些問題，但是，諸如瓶裝水、管道空氣之類無疑是誤解：瓶裝水或許是可樂與純凈水；而管道空氣或許與“氧吧”之類東西有關(guān)。它也可能是一種夸張，為了詮釋某種觀點而演繹出來的類似今天的段子的“故事”。

WES測序委托上海新培晶醫(yī)學(xué)檢驗所完成，平均測序深度150～200×。用Illumina Pipeline software(version1.3.4)讀出原始測序數(shù)據(jù)，采用本課題組前期建立的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)信息處理及生物信息學(xué)分析，明確致病基因突變位點并采用Sanger測序進(jìn)行突變位點鑒定[12]。檢測結(jié)果與對照樣本進(jìn)行比較，排除腫瘤遺傳易感基因突變。選擇突變率與初診時FCM檢測到的白血病細(xì)胞比例相當(dāng)?shù)捏w細(xì)胞基因突變作為MRD監(jiān)測的標(biāo)記物，若符合條件的腫瘤基因突變>5種時，選擇突變頻率最高的5種作為NGS-MRD檢測的標(biāo)記。

NGS-MRD檢測委托北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗實驗室完成，流程大致為[13-14]：按照qPCR引物要求設(shè)計引物，引物設(shè)計完成后，分別在上下游引物5′端添加tag序列(示例引物：上游引物：CGCTCTTCCGATCTacggccagtNNNNNN；下游引物：CGCTCTTCCGATCTactataggg NNNNNN)，其中NNNNNN為隨機(jī)引物。誘導(dǎo)治療結(jié)束后采集EDTA抗凝骨髓液并提取300 μL 基因組DNA，盡量減少洗脫體積增加濃度并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用hiseq2500測序儀器上機(jī)測序后，經(jīng)bcl2fastq-2.20轉(zhuǎn)化得到原始fastq序列文件，通過fastp(版本：v0.18.1，參數(shù)：-w 6 -l 50 -U --umi_loc per_read --umi_len 15)識別UMI并過濾原始fastq、得到帶有UMI標(biāo)記的clean fastq并進(jìn)行突變分析并記錄基因突變率，測序深度≥200 000×。突變率<0.001%為陰性；若2種及以上基因突變率≥0.001%時以中位值作為NGS-MRD檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1FCM-MRD結(jié)果 35例患兒BP-ALL及AML各有1例未找到LAIP，F(xiàn)CM-MRD檢測標(biāo)記的檢出率93.94%。誘導(dǎo)治療后35例均進(jìn)行FCM-MRD檢測，3例BP-ALL和2例MAPL陽性，陽性檢出率14.29%。FCM-MRD陽性BP-ALL定量結(jié)果分別為0.30%、0.05%和0.09%；FCM-MRD陽性MAPL均AML標(biāo)記陰性，ALL標(biāo)記分別為0.13%和5.05%。

2.2PCR-MRD結(jié)果 35例患兒中10例檢出白血病融合基因，PCR-MRD檢測標(biāo)記的檢出率為28.57%，分別有5例BP-ALL(TCF3-PBX1 2例，ZM1Z1-ABL、ETV6-RUNX1及MLL/AF9各1例)、1例T-ALL(SIL/TAL)、3例AML(RUNX1/RUNXT1 2例，CBFb/MYH11 1例)和1例MAPL(BCR/ABL)融合基因陽性。誘導(dǎo)治療結(jié)束后對10例初診融合基因陽性患兒進(jìn)行PCR-MRD檢測，2例初診RUNX1/RUNXT1陽性AML患兒PCR-MRD陽性，陽性率20%，其融合基因相對表達(dá)值分別為0.59和0.004。

2.3NGS-MRD結(jié)果 35例初診時篩選到1～7個不同的體細(xì)胞腫瘤基因突變致病位點，包括KIT、KRAS、NRAS、KMT2B、FLT3、ATM、FBXW7、NOTCH1、IKZF3等，平均檢出致病突變(3.03±0.27)個。以上述突變作為NGS-MRD檢測標(biāo)記，檢測標(biāo)記的檢出率為100%。誘導(dǎo)治療后，35例均行NGS-MRD檢測，20例結(jié)果為陽性，陽性率57.14%，陽性病例包括B-ALL 9例、T-ALL 2例、AML 6例及MPAL 3例。

2.43種MRD檢測方法比較 3種不同方法進(jìn)行MRD標(biāo)記篩選，NGS-MRD標(biāo)記檢出率最高(100%)，其次為FCM-MRD(93.94%)，而PCR-MRD標(biāo)記檢出率最低(28.57%)，其陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時對FCM、PCR及NGS標(biāo)記10例誘導(dǎo)治療后MRD水平進(jìn)行比較，其靈敏度仍以NGS-MRD方法最高(陽性率60%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。5例FCM-MRD陽性及2例PCR-MRD陽性患兒其NGS-MRD檢測結(jié)果均為陽性，見表2。

表1 3種MRD檢測方法的標(biāo)記篩選及MRD檢測結(jié)果

注：*表示PCR篩選僅10例有陽性標(biāo)記

表2 3種MRD檢測方法比較陽性結(jié)果比較

注：-表示無數(shù)據(jù)；MPAL的FCM-MRD結(jié)果為ALL細(xì)胞群；negative表示陰性

35例FCM-MRD檢測結(jié)果平均值為(0.016±0.014)%，NGS-MRD檢測結(jié)果平均值為(0.068±0.033)%，進(jìn)行配對比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.084)；如果按照ALL及AML進(jìn)行分組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(ALL：P=0.050；AML：P=0.190)；MPAL組因樣本量較小未作分析。以上結(jié)果提示NGS-MRD方法的特異性可能不低于其它兩種檢測方法，見圖1。

圖1 FCM-MRD及NGS-MRD檢測結(jié)果

3 討 論

AL是兒童期最常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率4/10萬～6/10萬，嚴(yán)重威脅兒童生命[1]。隨著診療技術(shù)進(jìn)步，兒童AL療效得到不斷提高，但終究有部分患兒疾病復(fù)發(fā)并導(dǎo)致死亡。目前認(rèn)為，治療達(dá)到CR 后患兒體內(nèi)仍剩余微量白血病細(xì)胞是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的重要因素[15]。因此，尋找可靠的指標(biāo)用于檢測AL患兒治療后MRD水平對于指導(dǎo)AL治療方案調(diào)整非常重要。

目前最為常用的MRD檢測方法包括：(1)FCM-MRD：即利用FCM確定患兒初診LAIP，治療中定期定量隨訪其表達(dá)水平[8-9]。該方法方便快捷，靈敏度達(dá)到0.001%，是臨床最常用的MRD檢測方法。但部分AL患兒無法找到合適檢測標(biāo)記，只能使用簡易標(biāo)記檢測MRD，檢查誤差較大，本研究的35例患兒中有2例未找到合適標(biāo)記；由于治療后白血病細(xì)胞表面的抗原漂移等原因，隨著化療時間延長，F(xiàn)CM-MRD檢測誤差也不斷增加；APL等部分AL亞型無法使用FCM檢測MRD水平；對于接受異基因造血干細(xì)胞移植、CAR-T療法等患兒細(xì)胞表面抗原發(fā)生改變[15-16]，難以應(yīng)用FCM檢測MRD；FCM-MRD靈敏度為10-3～10-4，相對較低；FCM-MRD方法受到檢測單位技術(shù)影響，且難以復(fù)核。(2)PCR-MRD：初診時利用PCR技術(shù)檢測患兒存在的白血病融合基因、治療后定期隨訪其基因表達(dá)情況[3]。該方法靈敏度可達(dá)10-5且特異性強(qiáng)，不受治療影響；PCR技術(shù)檢測到的融合基因類別還可以用于指導(dǎo)診療方案調(diào)整。因此，長期隨訪檢測時PCR-MRD技術(shù)可能好于FCM-MRD技術(shù)[3]。但文獻(xiàn)報道及本課題組前期研究均顯示，即使采用mutiplex RT-PCR技術(shù)進(jìn)行白血病融合基因檢測，仍然有超過50%的AL患兒初診時白血病融合基因檢測陰性[4-5]，不能用該方案檢測MRD；對于常見的融合基因可以采用qRT-PCR技術(shù)定量檢測并客觀有效地指導(dǎo)治療方案調(diào)整，而少見的融合基因型則只能采用RT-PCR技術(shù)定性檢測[11]。因此，需要尋找其它靈敏度高、特異性強(qiáng)的方法用于AL患兒MRD檢測。

各種原因誘發(fā)DNA損傷并導(dǎo)致的腫瘤基因突變是白血病細(xì)胞特異性的標(biāo)記，全外顯子組是人類全部外顯子組區(qū)域的總稱，是致病突變最為集中的區(qū)域，如果使用NGS技術(shù)對初診AL患兒進(jìn)行WES測序，理論上所有的白血病患兒都能發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞基因突變[17]，本研究中35例患兒均檢測到1～7種體細(xì)胞腫瘤基因突變。病初檢測到的體細(xì)胞腫瘤基因突變系白血病細(xì)胞突變所致，因此，我們設(shè)想將發(fā)現(xiàn)的基因突變作為分子標(biāo)記，治療后定量隨訪其突變比例可能是一種靈敏度和特異度均較高的MRD檢測方法。但每個AL患兒基因突變類別存在較大差異，本組患兒初診時篩選到1～7個不同的基因突變位點，若對每種突變都采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行PCR-MRD檢測，則需要設(shè)計大量不同的引物和多次反復(fù)檢測，耗時費力且成本高、質(zhì)控也難以進(jìn)行，并不適用于臨床。治療后患兒的白血病細(xì)胞及其基因突變比例均非常低，如果使用NGS測序檢測突變比例則需要超高深度進(jìn)行檢測，即SD-NGS測序[16]。但NGS測序的文庫構(gòu)建、目標(biāo)區(qū)域捕獲過程中都涉及到DNA聚合酶和擴(kuò)增，這樣會引入一些原始樣本基因組上并不存在的錯誤以及擴(kuò)增的偏好性[17]；測序環(huán)節(jié)則取決于不同的測序讀長、base calling算法及檢測的突變類型等，它的測序錯誤率可達(dá)1-0.05%[18]。這些系統(tǒng)錯誤，使得人們利用SD-NGS測序技術(shù)檢測低頻突變時，難以區(qū)分到底是真實的樣本突變還是由于這些系統(tǒng)錯誤所造成的假陽性。因此，直接進(jìn)行SD-NGS測序檢測MRD的假陽性概率明顯增加，使用顯著受限。

UMI又稱分子條形碼或分子標(biāo)簽[19]，是對原始樣本基因組打斷后的每一個片段都加上一段特有的標(biāo)簽序列，經(jīng)文庫構(gòu)建及PCR擴(kuò)增后一起進(jìn)行測序。UMI通常由10 nt左右隨機(jī)序列或簡并堿基組成。有別于樣品標(biāo)簽。UMI是針對同一個樣本中的不同片段加上的標(biāo)簽序列，而樣品標(biāo)簽是用于區(qū)分不同樣本而加上的標(biāo)簽序列，每一個樣本只有一個相同的樣品標(biāo)簽，但可以有成千上萬的分子條形碼[20]。這樣，根據(jù)不同標(biāo)簽序列就可以區(qū)分同一樣本中成千上萬不同的片段，在后續(xù)數(shù)據(jù)分析中可以通過這些標(biāo)簽序列來排除系統(tǒng)錯誤，分辨哪些是PCR擴(kuò)增及測序過程中的隨機(jī)錯誤造成的假陽性突變，哪些是患者真正攜帶的突變，從而提高檢測的靈敏度和特異度[18]。以本研究示范的上游引物為例，整個引物序列分為以下幾個部分：(1)CGCTCTTCCGATCT：為每個目的基因都專門設(shè)計的一個標(biāo)簽序列，隨著PCR擴(kuò)增后可以作為樣品標(biāo)簽區(qū)分不同的目的基因；(2)acggccagt：系目的基因的上游引物，PCR擴(kuò)增的目的基因序列；(3)NNNNNN：隨機(jī)引物，評估擴(kuò)增后是否發(fā)生隨機(jī)錯誤。

目前廣泛應(yīng)用的NGS測序技術(shù)的特點是廣覆蓋和測序深度較低，可以較好地檢出高頻突變，但頻率較低尤其是突變率低于1%的時候誤差較大。而UMI標(biāo)記的NGS技術(shù)的優(yōu)點在于可以同時兼顧測序深度，檢出極低頻率的突變，但同時又不增加測序的假陽性誤差。既往UMI技術(shù)主要用于微量DNA檢測，如：考古、物種鑒定及公安機(jī)關(guān)偵查鑒定等[19]。AL患兒化療后殘留的白血病細(xì)胞極少，如果采用傳統(tǒng)NGS測序技術(shù)則誤差較大，因此本研究設(shè)計并建立使用UMI技術(shù)標(biāo)記后的SD-NGS技術(shù)進(jìn)行MRD檢測。

對于ALL及MPAL的ALL細(xì)胞群，F(xiàn)CM快捷方便且可靠性較高，已經(jīng)成為MRD檢測的常規(guī)方法[8]，而對于AML和MPAL患兒的AML細(xì)胞群，F(xiàn)CM檢測的應(yīng)用尚有爭議[21-22]。本研究采用的NGS-MRD技術(shù)靈敏度(10-5)稍高于FCM-MRD技術(shù)(10-4)；而對于AML和MPAL患兒的AML細(xì)胞群，NGS-MRD技術(shù)的靈敏度則明顯高于FCM-MRD技術(shù)(10-3)。PCR-MRD靈敏度雖然較高，但超過50%的AL患兒無法采用PCR-MRD技術(shù)。

4 結(jié) 論

總之，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，NGS技術(shù)和WES測序已經(jīng)在白血病診療中得到廣泛應(yīng)用。本課題組首先采用WES測序技術(shù)給每個AL患兒都能夠找到合適的腫瘤基因突變位點作為MRD分子標(biāo)記，再采用UMI標(biāo)記的SD-NGS技術(shù)對基因突變位點進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示NGS-MRD技術(shù)的靈敏度和特異度都不低于FCM-MRD和PCR-MRD技術(shù)，且通過WES測序還可以發(fā)現(xiàn)對治療方案和預(yù)后有指導(dǎo)意義的基因突變，可能是一種新的白血病MRD檢測方法。但本研究的樣本量較小，且對于不同亞型的AL患兒本方法對于指導(dǎo)臨床診療是否具有相同效果尚需進(jìn)一步研究。