HPLC法測定大鼠靜脈注射色胺酮的血藥濃度及其藥代動力學(xué)研究

吳青青， 黃和平， 汪電雷， 黃 鵬， 姚兆敏， 吳 潔， 方 偉

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

色胺酮主要來源為十字花科植物菘藍 (IsatisindigoticaFortune)、爵床科植物馬藍 (Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)、豆科植物木藍 (IndigoferatinctoriaLinn)、蓼科植物蓼藍 (PolygonumtinctoriumAit)等，是吲哚喹唑啉類生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為吲哚并[2,1-B]喹唑啉-6,12-二酮，由于其在天然植物中含量極低，現(xiàn)多通過人工合成[1-2]。近年來對色胺酮的研究表明其具有抗菌[3]、抗炎[4-6]、抗腫瘤[7-10]以及抗寄生蟲等藥理活性，且有研究報道色胺酮毒性較低，安全性良好[11-12]，具有良好的研究與開發(fā)前景。目前，關(guān)于色胺酮的研究多報道其合成及臨床應(yīng)用和藥理作用機制等，而對于大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究較少，本試驗建立HPLC法測定大鼠靜脈注射色胺酮后血漿中的藥物濃度，并考察在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)，為其進一步開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

LC-16高效液相色譜儀(日本島津公司)，Milli-Q Gradient A10超純水(Millipore Inc．USA)，AS5150A型超聲清洗儀(Autoscience公司)，Vortex-genie 2渦旋混合器(美國 Scientific Industries公司)，Centrifuge 5804R臺式高速離心機(上海東兢電子有限公司)；BP211D型電子天平(德國Sartorius公司)。

色胺酮標準品(≥ 97%，批號SY017117，上海韶遠科技有限公司)；乙腈(色譜純)，N,N-二甲基甲酰胺(色譜純，阿拉丁)，試驗用水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重200±20 g，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(皖) 2017-001，試驗前12 h內(nèi)，禁食不禁水。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 HC-C18 (250 mm×4.6 mm)，流動相為乙腈-水(53∶47，v/v)，流速:1 mL/min，檢測波長251 nm，柱溫為30 ℃，進樣量20 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取色胺酮1.0 mg于容量瓶中，加適量乙腈超聲溶解，定容至刻度。精密吸取儲備液，用乙腈稀釋成濃度為0.6、1.5、3、6、15、20 μg/mL的對照品溶液[13-15]。

1.3.3 內(nèi)標溶液的制備 精密稱定內(nèi)標物4(3H)-喹唑酮標準品1 mg置于10 mL量瓶，加適量乙腈超聲溶解，定容至刻度，得內(nèi)標儲備液(100 μg/mL)，臨用前精密吸取適量，用乙腈稀釋成3 μg/mL的工作液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 生物樣品處理及分析 取血漿100 μL置于1.5 mL EP管中，加入10 μL內(nèi)標工作液，然后加入250 μL乙腈沉淀蛋白，于渦旋混合器上混勻3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，進樣20 μL，采用建立的HPLC方法進行檢測分析。

1.4 藥代動力學(xué)實驗

取6只SD大鼠，試驗前禁食12 h，自由飲水。尾靜脈注射色胺酮藥液75 mg/kg(以色胺酮計)，按5 mL/kg體積注射。分別在給藥前和給藥后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h于眼眶取血0.5 mL放置在1.5 mL肝素化EP管中，-20 ℃冷凍保存，備用。按1.3.4節(jié)下步驟處理，20 μL進樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗

取空白血漿，空白血漿加對照品溶液和單劑量尾靜脈注射色胺酮0.083 h后大鼠血漿按1.3.4節(jié)下方法處理后，在1.3.1色譜條件下進樣測得的血漿樣品色譜圖如圖1，結(jié)果表明在該色譜條件下，色胺酮與內(nèi)標物出峰時間保留時間恰當，且各峰分離度良好沒有雜峰干擾。

注：A.空白血漿；B.空白血漿加內(nèi)標物4(3H)-喹唑酮(1 μg/mL)；C.空白血漿加色胺酮(1 μg/mL)；D.靜脈注射給藥0.083h含藥血漿，1.4(3H)喹唑酮；2：色胺酮

2.2 線性范圍及定量下限

分別取大鼠空白血漿90 μL置于1.5 mL EP管中，分別加入10 μL一系列混合標準溶液配制成血漿中色胺酮濃度為0.06、0.15、0.3、0.6、1.5、2 μg/mL，按1.2.4節(jié)下操作，以1.3.1節(jié)下色譜條件進樣分析。以血漿中色胺酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，以色胺酮峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(Y)，用最小二乘法回歸運算，得到直線回歸方程：Y=13.711x-0.389 5。結(jié)果表明，色胺酮在0.06～2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度與準確度

取大鼠空白血漿90 μL，加入0.6、1.5、3、15 μg/mL的對照品溶液各10 μL配制定量下限、低、中、高濃度(0.06、0.15、0.3、1.5 μg/mL)的質(zhì)控樣品，每個濃度平行做5份，重復(fù)3個分析批，按血漿處理方法處理，以1.3.1節(jié)下色譜條件進樣分析，記錄血漿樣品中每個藥物的峰面積Ax。以當天隨行標準曲線分別計算每個樣品的實測濃度。各分析批樣品以該分析批內(nèi)制備的隨行標準曲線分別計算其實測濃度，連續(xù)測3 d(表1)。

表1 精密度和準確度測定結(jié)果(n=5)

2.4 穩(wěn)定性

按2.3節(jié)配制濃度為低、高三種濃度的含藥血漿樣品，每種濃度平行3樣本，按1.3.1節(jié)下色譜條件進樣分析，分別考察樣品反復(fù)凍融3次、室溫放置4 h、長期放置-20 ℃冰箱凍存兩周以及反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性如表2。

表2 穩(wěn)定性測定結(jié)果 (n=3)

2.5 提取回收率

取大鼠空白血漿90 μL，分別加入1.5、3、15 μg/mL三種濃度標準品溶液各10 μL制備低、中、高(0.15、0.3、1.5 μg/mL)三種濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行5份，按1.3.4節(jié)下方法處理，進樣分析，記錄血漿樣品中每個藥物的峰面積As(H)。同時取90μL空白血漿，以空白血漿與乙腈1∶2.5(v/v)制備空白血漿上清液，分別加入標準品溶液制備相同低、中、高濃度的含空白血漿的色胺酮對照品溶液，分別進樣測定,記錄樣品中每個藥物的峰面積As(D)?；厥章?As(H)/As(D)平均值×100%,計算得到此方法下色胺酮的提取回收率。每個濃度平行做5份。結(jié)果表明，提取回收率均>85%，RSD<10%，符合生物樣品分析方法驗證要求。

2.6 藥物動力學(xué)

大鼠靜脈注射色胺酮后平均血藥濃度-時間曲線如圖2。用 DAS 3.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計算藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表3，在體內(nèi)符合二室模型特征。

圖2 大鼠靜脈注射色胺酮后血漿中平均血藥濃度-時間曲線(X±S, n=6)

參數(shù)單位MeanSDt1/2αh0.1330.168t1/2βh2.1930.971V1L/kg33.79427.797CLL/(h·kg)29.7627.98AUC(0-t)mg/(L·h)4.2883.089AUC(0-∞)mg/(L·h)4.6163.307K101/h44.36467.785K121/h18.72619.864K211/h1.8021.413

3 結(jié)論與討論

本試驗考察甲醇-水，乙腈-水的不同比例流動相，比較結(jié)果表明乙腈-水(53∶47，v/v)作為流動相最為合適，該條件下內(nèi)標與色胺酮保留時間合理，且互不干擾，峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾實驗結(jié)果。在內(nèi)標的選擇上根據(jù)有關(guān)文獻資料選取與色胺酮結(jié)構(gòu)相似的4(3H)-喹唑酮[16-18]，其在優(yōu)化的色譜條件下與色胺酮的分離度及峰形均良好，在波長的選擇上比較不同波長下色胺酮的吸收，結(jié)果表明在251 nm波長下，色胺酮吸收最大。生物樣品處理采用乙腈沉淀蛋白，樣品的內(nèi)標峰與目標峰分離度良好且無雜質(zhì)干擾。靜脈注射色胺酮藥物后,t1/2β為2.193 h，AUC(0-∞)4.616 mg/(L·h)，V1為33.794 L/kg，CL 29.76 L/h/kg,表明色胺酮在大鼠體內(nèi)吸收、代謝過程較快，在體內(nèi)分布廣泛。