微生物凝乳酶研究進展

曾祺，張志國

(齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟南250353)

0 引 言

凝乳酶（MCE）通常專用于指代能夠誘導(dǎo)牛奶凝乳形成的功能性酶制劑，現(xiàn)凝乳酶的來源主要有四種：動物性來源、植物性來源、微生物來源及通過生物工程改造的微生物發(fā)酵所得[1]。乳制品行業(yè)日益增長的需求使得傳統(tǒng)凝乳酶（動物性來源）無法滿足市場需要，20世紀60年代初開始，在世界范圍內(nèi)人們就已經(jīng)開始尋找動物性凝乳酶的替代物；而微生物凝乳酶（MCEs）良好的功能特性及低廉的生產(chǎn)成本使其成為傳統(tǒng)凝乳酶的重要替代品之一，有資料顯示，到目前為止，微生物凝乳酶已用于全球三分之一奶酪的生產(chǎn)中。

傳統(tǒng)的動物性凝乳酶（小牛皺胃凝乳酶）的凝乳酶最初是以凝乳酶原存在，其分子量為40777 u，由365個氨基酸組成[2]。在酸性條件下，不具有凝乳活性的非活性凝乳酶自水解可生成兩種活性蛋白[3]：在pH4.2時，自水解剪切N末端的42個氨基酸，形成分子量為35 622 u(323個氨基酸)有活性的凝乳酶（chymosin）；以及在pH2.0時，自水解剪切N末端的27個氨基酸，形成生成分子量為37 400（337個氨基酸）組成的假凝乳酶（pseudochymosin），后者在pH為4.5時可轉(zhuǎn)化為凝乳酶（chymosin）。

凝乳酶蛋白結(jié)構(gòu)具有酸性蛋白酶家族的類二折疊對稱的結(jié)構(gòu)特點，主要是由氨基酸殘基和水分子在活性位點形成廣泛的氫鍵網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以維持的，與其他真核細胞天冬氨酸蛋白酶有高度的同源性。凝乳酶由1-175氨基酸殘基的N端與176-323的C端組成，深溝狀活性區(qū)域位于N、C端區(qū)域分界，兩個天冬氨基酸活性位點：Asp-34和Asp-216位于深溝狀活性區(qū)域底部[4]。其高級結(jié)構(gòu)以β片層結(jié)構(gòu)為主，與其他折疊方式一起形成了凝乳酶蛋白的腎狀結(jié)構(gòu)。大量的分子間及分子內(nèi)氫鍵、二硫鍵維持了凝乳酶蛋白結(jié)構(gòu)及催化性能的穩(wěn)定；其中，二硫鍵Cys-250和Cys-283的變化（羧基化或汞化）會直接影響凝乳酶的催化活性。由于兩個等位基因的不同表達，凝乳酶根據(jù)第244位氨基酸殘基的不同又分為凝乳酶A（殘基為Asp）和凝乳酶B（殘基為Gly），相較而言，凝乳酶A由于244位上的Asp具有強電子活性[5]從而具有比凝乳酶B更高的對κ-酪蛋白的催化活性，但同時，凝乳酶A的穩(wěn)定性比凝乳酶B低。

微生物是凝乳酶的良好來源，產(chǎn)生的凝乳酶的凝乳過程與動物性凝乳酶類似：在適當?shù)耐獠織l件（適當?shù)臏囟取H、離子濃度等）下，特異性水解κ-酪蛋白的特殊肽鍵，從而使其親水C端部分的酪蛋白巨肽釋放到乳清中，κ-酪蛋白天然結(jié)構(gòu)的改變使分子間斥力喪失，酪蛋白膠束聚集并開始形成三維凝乳網(wǎng)絡(luò)[6]。據(jù)報道：現(xiàn)已有40余種微生物可產(chǎn)生凝乳酶；超過100種真菌通過各種生物技術(shù)手段作為生產(chǎn)凝乳酶的既定來源[7]；在已有的對微生物來源的凝乳酶研究中，大部分微生物凝乳酶（MCEs）表現(xiàn)出比動物性凝乳酶高的催化活性及穩(wěn)定性[8]，這些特性在乳品行業(yè)中具有重要的意義。

1 產(chǎn)凝乳酶的微生物概述

1.1 天然產(chǎn)凝乳酶微生物

現(xiàn)階段，微生物凝乳酶（MCEs）的來源主要是放線菌、細菌、真菌等[9]，如：米曲霉（Aspergillus-oryzae）、栗疫菌（Endothia parasitica）、米黑毛霉（Mucor miehei）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[10-12]等。微生物凝乳酶本質(zhì)上屬于蛋白質(zhì)水解酶，根據(jù)其催化類型的不同分屬天冬氨酸蛋白酶（Aspartic proteases）[13]，金屬蛋白酶（Metallo proteases）[14]，絲氨酸蛋白酶（Serine proteases）[15]等蛋白酶種類；微生物蛋白酶的巨大多樣性，使其在滿足不同食品工藝要求方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。

1.2 生物工程技術(shù)改造的產(chǎn)凝乳酶微生物

1.2.1DNA重組（rDNA）技術(shù)

早在90年代，重組小牛凝乳酶已經(jīng)由美國食品及藥品監(jiān)督管理局（FDA）登記注冊，成為第一種由DNA重組技術(shù)制造的食品添加劑[22]。通過分析確定的控制凝乳酶產(chǎn)生的基因序列，將其導(dǎo)入至產(chǎn)酶性能優(yōu)良的GRAS微生物中[23]，這種利用特定基因在常用工業(yè)菌株中的異源表達已經(jīng)成為獲取微生物凝乳酶的重要手段。

Lucía Feijoo-Siota[24]等將蓬子菜（Galium verum）中控制凝乳酶合成基因?qū)氲桨退沟庐叧嘟湍福≒ichia pastoris）中成功使其表達，并激活產(chǎn)生的凝乳酶使其具凝乳功能；Nan Wang[25]等人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將駱駝凝乳酶基因?qū)胫涟退沟庐叧嘟湍福≒ichia pastoris）中，并使轉(zhuǎn)基因菌株表達了完整的駱駝凝乳酶原基因，重組凝乳酶表現(xiàn)出高凝乳活性及良好的熱穩(wěn)定性。

盡管利用DNA重組技術(shù)可顯著降低凝乳酶的生產(chǎn)成本，但也有一定的局限性，由于改變的僅是工程菌種中的一小部分基因，得到的重組工程菌種中產(chǎn)凝乳酶基因的表達及凝乳酶性狀有一定程度的不確定性，因此不一定能得到理想的凝乳酶。

1.2.2 基因非定向誘變

基因非定向誘變是指利用人工手段誘使微生物遺傳物質(zhì)改變，從而使其性狀發(fā)生改變。利用UV輻射或化學(xué)誘變劑的誘變可快速選育出性狀組合優(yōu)良的誘變體；也可人工干預(yù)微生物DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄等途徑得到理想的突變體。

Elizabeth A.Bodie[26]等人利用無性重組技術(shù)，經(jīng)過誘變、篩選后得到了比親本菌株高產(chǎn)15%凝乳酶的菌株，并確定了整合的凝乳酶DNA序列在染色體上的位置。王成忠[27]等利用復(fù)合(紫外和硫酸二乙酯)誘變處理出發(fā)菌株藍色刺孢霉，選育出高產(chǎn)凝乳酶藍色刺孢霉菌株；通過與小牛皺胃酶酶切位點比較,得出水解產(chǎn)物和小牛皺胃酶的基本相同。通常，突變?nèi)菀滓鸬鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致微生物原本的功能惡化。少數(shù)情況下，通過突變導(dǎo)致的DNA結(jié)構(gòu)組分的改變會使微生物功能性狀改善。而微生物性狀的改變通常伴隨著調(diào)節(jié)功能的喪失，但這種情況通常是必須的，例如：調(diào)節(jié)功能喪失導(dǎo)致酶產(chǎn)量增加。突變和選育主要是針對更高的整體生產(chǎn)力而非特定功能的突變，所以調(diào)節(jié)功能的喪失是很難避免的。

微生物繁殖轉(zhuǎn)化快，結(jié)構(gòu)簡單，安全性高，易變異的特點使得微生物在食品酶制劑的生產(chǎn)中扮演十分重要的角色；微生物對外源基因的兼容性使得被導(dǎo)入的外源基因可在其體內(nèi)進行表達，這些特性為微生物凝乳酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供了無限的可能。

2 微生物凝乳酶的生產(chǎn)

眾所周知，微生物酶制劑的生產(chǎn)過程中，發(fā)酵是起決定作用的一個環(huán)節(jié)，發(fā)酵的目標是生產(chǎn)經(jīng)濟、安全、性能優(yōu)良的酶產(chǎn)品；其過程由許多操作單元構(gòu)成。對于MCEs的生產(chǎn)來說，最大的酶制劑得率仍然是最重要的影響因素；而最低的單位生產(chǎn)成本也是影響MCEs生產(chǎn)的重要的因素。優(yōu)化每個操作單元并不一定能得到最佳的整體過程性能，尤其是當每個操作單元之間存在強烈的相互作用時[28]。因此，了解這些相互作用對凝乳酶生產(chǎn)的整體過程優(yōu)化至關(guān)重要。

表1 不同微生物產(chǎn)生的凝乳酶的特性

生產(chǎn)微生物來源的凝乳酶的過程大體可分為兩步：首先，選擇培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以優(yōu)化酶產(chǎn)量并增加凝乳酶的凝乳活性與其蛋白水解活性的比例（MCA/PA），選擇合適的發(fā)酵方式（連續(xù)、分批、補料分批）進行深層液態(tài)發(fā)酵（SMF）或固態(tài)發(fā)酵（SSF）；隨后，將所得粗酶進行純化并被對酶進行修飾或改性以改善它們的功能性質(zhì)，如:降低凝乳酶的蛋白水解活性，防止干酪苦味的產(chǎn)生；升高或降低凝乳酶的熱穩(wěn)定性以滿足不同的使用需要等方面[29]。

2.1 產(chǎn)凝乳酶微生物的發(fā)酵

微生物水分活度高的過量游離水中發(fā)酵稱為深層液態(tài)發(fā)酵（SMF）[30]，是典型的涉及產(chǎn)胞外酶微生物的發(fā)酵過程，相比于固態(tài)發(fā)酵（SSF），深層液態(tài)發(fā)酵（SMF）規(guī)模大，發(fā)酵過程參數(shù)易于控制，不存在傳質(zhì)及散熱問題；并根據(jù)不同的生產(chǎn)需要有4種方式可選：分批培養(yǎng)，補料分批培養(yǎng)，灌注分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。這些優(yōu)勢使其大規(guī)模運用于各類酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)。固態(tài)發(fā)酵中，微生物生長在較低水分含量及活度的環(huán)境中[31]，發(fā)酵過程較為粗放，對那些粗發(fā)酵產(chǎn)品可直接用作酶源的工藝而言，它具有特殊意義。相較于深層液態(tài)發(fā)酵（SMF），固態(tài)發(fā)酵（SSF）效價高，產(chǎn)物濃度較高，成本較為低廉。對于發(fā)酵類型的選擇，需要結(jié)合實際的生產(chǎn)情況及微生物的特性，并經(jīng)過試驗確定。Chwen-Jen Shieh[32]等人同時利用固態(tài)及液態(tài)2種方式發(fā)酵來自納豆中的4種凝乳酶產(chǎn)生菌種：枯草芽孢桿菌（納豆）ATCC 7058，枯草芽孢桿菌（納豆）ATCC 7059，枯草芽孢桿菌（納豆）IFO 13169，枯草芽孢桿菌（納豆）IFO 3335，對比了2種發(fā)酵方式下4種菌種產(chǎn)凝乳酶的活性、蛋白水解活性及熱穩(wěn)定性。

微生物培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無機鹽、生長因子等組分構(gòu)成，不同產(chǎn)凝乳酶的微生物對培養(yǎng)基組成成分，各組分含量及配比要求不同，為得到最優(yōu)的發(fā)酵條件，必須經(jīng)過大量的實驗研究。

2.2 微生物凝乳酶的純化

純化過程的目標是在既定純化條件下實現(xiàn)最高的回收率、最大的催化活性和最高的純度。大多數(shù)食品工業(yè)用微生物凝乳酶為胞外酶，純化的第一步即是從發(fā)酵液中分離細胞；對于細胞內(nèi)酶，則需要通過機械或非機械方法破壞細胞，而后經(jīng)過濾、離心、絮凝、浮選和最后的濃縮純化制得[33]，所以，胞外酶對于工業(yè)應(yīng)用而言更為理想，因為每個下游過程都更加經(jīng)濟。然而，純化步驟的數(shù)量和經(jīng)濟可行性與所需純度高度相關(guān)，這反過來又與酶的最終應(yīng)用有關(guān)。

因此，在MCEs的生產(chǎn)中，最終的應(yīng)用決定酶的純化程度及步驟。特別是對于食品行業(yè)來說，純化是至關(guān)重要的。所有MCEs的純化步驟及其原理不盡相同，但也有即定的純化流程和原則可循；高容量低價值的MCEs應(yīng)該使純化步驟的程度最小化，使其符合經(jīng)濟要求。

2.3 微生物凝乳酶的固定化及修飾

在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，任何微小的化學(xué)或物理因素引起的MCEs自然構(gòu)象的永久或暫時變化都會影響其催化功能；因此常采用固定化及改性等手段提升MCEs的使用性，利用酶的固定化技術(shù)與酶的物理化學(xué)修飾可有效提升凝乳酶在乳制品制造中工藝條件下有限的穩(wěn)定性以及純酶制劑的利用率[34]。

Rajesh KumariNarwal等人[35]利用藻酸鹽-果膠形成的高分子聚合物對從枯草芽孢桿菌MTCC10422純化得到的凝乳酶進行包埋固定，固定化酶的產(chǎn)率達73%，并保留了大部分凝乳酶活力；經(jīng)過固定化后的MCEs具有更廣的PH使用范圍及更高的熱穩(wěn)定性。

Hala RefaatWehaidy等人[36]將枯草芽孢桿菌KU710517產(chǎn)生的凝乳酶與4種活化的多糖結(jié)合，在所有的偶聯(lián)物中，與聚乙二醇（PEG）結(jié)合的凝乳酶顯示出最高的保留活性，為95.3%，研究表明：與PEG偶聯(lián)的凝乳酶具有更高的催化效率與更高的熱穩(wěn)定性。

根據(jù)應(yīng)用及酶本身的特性，MCEs的固定化及修飾方法不盡相同；但根據(jù)具體應(yīng)用中的要求，評估固定化及改性后的酶的標準基本上保持不變，即單位質(zhì)量中的高活性，高選擇性（減少副反應(yīng)），高穩(wěn)定性（通過有效再利用降低成本），經(jīng)濟和創(chuàng)新性。

3 微生物凝乳酶的應(yīng)用中存在的問題與對策

目前，微生物蛋白酶已占據(jù)了全球酶市場份額的65%，微生物凝乳酶更是占到了全球蛋白酶市場份額的33%。然而，在如此廣闊的市場前景下，微生物凝乳酶的應(yīng)用仍然受到許多條件的制約，如何打破這些制約微生生物凝乳酶發(fā)展的壁壘成為了現(xiàn)階段微生物凝乳酶應(yīng)用中亟待解決的問題。

3.1 苦味肽的產(chǎn)生及積累

具有良好催化效用的微生物凝乳酶需具備以下特征[37]：（1）在干酪加工過程中的pH與溫度條件下保持較高的活力，形成的凝乳具有更加緊密和相互作用的結(jié)構(gòu)。（2）具有較高的κ-酪蛋白水解活力(MCA)及較低的非特異性蛋白水解活力(PA)，通常情況下利用MCA/PA值來作為微生物凝乳酶的催化評價指標。（3）具有較高的熱敏性，較低的熱失活溫度的微生物凝乳酶更加適用于干酪的生產(chǎn)。而微生物凝乳酶受自身特性的影響，通常具有較低的MCA/PA值與較高的熱穩(wěn)定性，這些特性導(dǎo)致了在微生物凝乳酶介導(dǎo)的凝乳過程中大量的苦味肽產(chǎn)生及積累。

現(xiàn)階段的研究表明：苦味肽的產(chǎn)生主要來源于凝乳酶對αs1-CN和β-CN的水解，這種水解通常發(fā)生在凝乳過程中凝乳酶對蛋白的過度水解以及成熟干酪中殘留的凝乳酶對蛋白的水解[38]，αs1-CN是一條富含脯氨酸的由199個氨基酸構(gòu)成的單鏈磷酸化蛋白質(zhì)，在干酪成熟過程中易被降解產(chǎn)生苦味肽。β-CN中易感Leu192-Tyr193肽鍵水解后將會產(chǎn)生的β-CN f193-209肽段，這些肽段的產(chǎn)生與積累是干酪苦味的重要來源[39]?？偠灾?，對于微生物凝乳酶所生產(chǎn)的干酪，其苦味來源于具有疏水性氨基酸末端、分子量分布于100～6 000 u之間的小肽，這些小肽通常具有較低的苦味閾值，并且苦味的強弱與其疏水性氨基酸含量呈正相關(guān)。

3.2 降低干酪苦味的研究

根據(jù)微生物凝乳酶產(chǎn)生苦味肽的機理，降低干酪苦味的方法主要通過兩種途徑實現(xiàn)：一種是通過減少微生物凝乳酶介導(dǎo)凝乳過程中苦味肽的產(chǎn)生；另一種為通過外源因素控制降低干酪中所積累的苦味肽含量。通過選用適宜的凝乳酶、外肽酶、改進干酪的生產(chǎn)工藝等手段可有效降低干酪中的苦味。

3.2.1 選用性狀優(yōu)良的凝乳酶

在選擇微生物凝乳酶用于干酪生產(chǎn)時，為降低苦味肽的產(chǎn)生及積累，應(yīng)選擇具有高MCA/PA（凝乳活性/非特異性蛋白水解活性值）以及熱敏性微生物凝乳酶；在微生物凝乳酶介導(dǎo)的凝乳過程中，不當?shù)腗CA/PA值會導(dǎo)致苦味肽的大量產(chǎn)生及積累，而非熱敏性的凝乳酶在凝乳過程完成后，無法完全滅活，導(dǎo)致干酪在儲存及貨架期內(nèi)仍然具有苦味肽及產(chǎn)生及積累。

為得到性狀優(yōu)良，適用于干酪生產(chǎn)的微生物凝乳酶，科學(xué)研究工作者結(jié)合相關(guān)生物技術(shù)，如：蛋白質(zhì)工程、基因工程等手段獲得了豐富的微生物凝乳酶資源；為從源頭解決干酪苦味的難題提供了根本性的解決方案。

3.2.2 使用肽酶降解苦味肽

現(xiàn)階段研究者已發(fā)現(xiàn)多種可降解苦味肽的肽酶，這種能有效降低干酪苦味的方法廣泛用于各類干酪的生產(chǎn)中，運用較為廣泛的兩種脫苦的混合外肽酶：Accelase和Debitras能有效降解干酪中的苦味肽，從而降低干酪苦味。隨著研究者對苦味肽研究的深入，不斷地有新型能降解苦味肽的肽酶被發(fā)現(xiàn)，來自Lacto?coccus lactis ssp.cremoris Lactococcus lactis ssp.cremoris SK11中的肽酶可有效降解Cheddar干酪中的苦味肽[40]；Tomoko shi Ma Mura等[41]從9株可降解源自β-CN產(chǎn)生的苦味肽的乳酸菌菌株中優(yōu)選出具有較高的降解苦味肽能力的L.lactis ssp.lactis L.lactis ssp.lactis 527，其產(chǎn)生的肽酶可有效降低干酪的苦味；Bouchier等[42]發(fā)現(xiàn)來自Lactis spp.cremoris lactis spp.cremorisAM2中的脯氨酸氨肽酶也能有效降解源自于β-CN產(chǎn)生的苦味肽；Ramarathna Koka等發(fā)現(xiàn)[43]從Pseudomonas fluorescens RO98提取分離的蛋白酶能夠降解Cheddar和Gouda干酪中的苦味肽。因此，在干酪生產(chǎn)過程添加合適的肽酶可有效降低干酪苦味，得到性狀優(yōu)良的產(chǎn)品。

3.2.3 改進干酪生產(chǎn)工藝

在干酪的生產(chǎn)過程中，可改進干酪生產(chǎn)工藝而減少苦味肽的產(chǎn)生，與其他手段相結(jié)合，能夠達到理想的減少干酪苦味的效果。

干酪生產(chǎn)過程中的增加鹽濃度可顯著降低β-CN降解所產(chǎn)生苦味肽的含量，但對αs1-CN的降解效用不明顯[44]，在不影響干酪性狀的條件下提高鹽濃度也是減少苦味肽積累的方法。P.Agrawal等[45]利用超濾濃縮原料乳，減少了發(fā)酵劑及凝乳酶的添加量，所得到的低脂Cheddar干酪的苦味明顯減少。此外，減少凝乳酶在干酪產(chǎn)品中殘余的活性也是抑制干酪苦味產(chǎn)生的方法。

4 微生物凝乳酶的未來發(fā)展

預(yù)計到2030年大約40%的大規(guī)?；瘜W(xué)合成工藝將被酶促轉(zhuǎn)化所取代；這與世界酶需求每年增加6.7%的事實相一致，凝乳酶作為食品工業(yè)酶制劑的重要組成，面對日益增長的市場需求，結(jié)合相關(guān)前沿生物技術(shù)手段優(yōu)化提升微生物凝乳酶制劑的上下游生產(chǎn)技術(shù)過程是十分重要的。

4.1 定向進化與微生物凝乳酶

除了上文已經(jīng)提到的DNA重組技術(shù)和非定向誘變技術(shù)，生物信息學(xué)的分子設(shè)計被廣泛應(yīng)用于各類酶催化性能的優(yōu)化及合理合成技術(shù)的未來發(fā)展中，如定向進化。

定向進化是利用修飾酶以提高催化性能的最有效和實用的手段。基于合理設(shè)計的定向進化可以進一步改善酶的性質(zhì)。該技術(shù)利用易錯聚合酶鏈反應(yīng)（ep-PCR），DNA改組，交錯延伸過程（StEP）等手段在體[46]外引導(dǎo)選擇性壓力，使得RNA，蛋白質(zhì)，代謝途徑，遺傳過程甚至整個細胞以迭代的方式進化[47]，再對特定功能或性質(zhì)進行高通量篩選；通過建立穩(wěn)定可靠的表型-基因型關(guān)系，可定向地設(shè)計培養(yǎng)理想的突變體，從而得到理想性狀的酶。本質(zhì)上，體外定向進化是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可利用優(yōu)化其組合或?qū)σ延卸嚯慕Y(jié)構(gòu)進行替換達到進化的目的，這些重組模塊的單元可能是蛋白質(zhì)中簡單的二級結(jié)構(gòu)單元或更大一些的多肽片段，此類進化過程可由外顯子重組、非同源重組和選擇性剪切導(dǎo)致，可挑選組合文庫中的蛋白進行規(guī)?；S機重組進行模擬[48]，從而達到定向進化的要求。即使定向進化是一種提升酶性狀的有效方法，但如何權(quán)衡理想的功能性狀和必要功能性狀之間的關(guān)系，仍是阻礙定向進化過程的重要因素。

隨著越來越多的產(chǎn)生突變體文庫方法的出現(xiàn)（如遺傳漂變，循環(huán)排列組合，原始基因文庫等），以及基于誘變PCR和重組的適應(yīng)性進化技術(shù)，運用這些技術(shù)手段設(shè)計高通量和超高通量篩選試驗可有效提升實驗效率[49-50]。最近，定向進化與計算/計算機/計算機算法的耦合使我們更接近實現(xiàn)理想的生物技術(shù)目標，但就現(xiàn)在來說，這些目標的實現(xiàn)仍有很長的路要走[51-56]。

4.2 宏基因組學(xué)與微生物凝乳酶

得益于近代高通量DNA測序技術(shù)的進步，宏基因組學(xué)也迎來了巨大的發(fā)展機遇；基于近代大規(guī)模并行測序技術(shù)的宏基因組學(xué)使人們對未知微生物群體環(huán)境中的總DNA研究成為可能，從而人們可以根據(jù)理想的性狀得到與此性狀相關(guān)的基因序列，可以定向地從復(fù)雜、未知的微生物群體環(huán)境中得到理想的酶或微生物。

相較于運用蛋白質(zhì)工程手段的工程酶獲取方式，宏基因組學(xué)無需對微生物或酶進行分離、提純，對酶的相關(guān)結(jié)構(gòu)沒有硬性的特殊要求，理論上來說，宏基因組學(xué)是一種無需依賴培養(yǎng)，能夠?qū)?fù)雜微生物環(huán)境中的任一DNA進行研究的方法，可從豐富的微生物群體中無限制地獲取理想性狀的酶；但現(xiàn)實不盡如人意，從宏基因組學(xué)理論提出到現(xiàn)在，過去的20年中，已有超過2100個國家及地區(qū)運用過這種技術(shù)，60%的研究對象來源于海洋樣品，所有的研究中只有11%定性了找到的新酶，值得注意的是，在這些有限的研究成果中，只有6100種具有活性的酶被提取出來。

現(xiàn)階段仍有95%的微生物未被人們發(fā)現(xiàn)，其中蘊含著可改變?nèi)祟愇拿鬟M程的生物資源寶庫，宏基因組學(xué)就是開啟寶庫的鑰匙，對于未來日益嚴峻的資源匱乏情況，宏基因組學(xué)的應(yīng)用和進步是十分重要的。

4.3 蛋白質(zhì)工程與微生物凝乳酶

利用蛋白質(zhì)工程的原理及方法探尋微生物凝乳酶中結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)、輔酶與功能性質(zhì)、基團及氨基酸與功能性質(zhì)之間的聯(lián)系，從而對凝乳酶進行定向改造，合理修飾改進微生物凝乳酶的相關(guān)結(jié)構(gòu)，使其一級或高級結(jié)構(gòu)發(fā)生可控的、系統(tǒng)的改變，從而得到具有高凝乳活性、良好底物專一性、高熱穩(wěn)定性等酶學(xué)特性凝乳酶，也是一種具有廣闊發(fā)展前景的方法。得益于現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，科研工作者們在這一領(lǐng)域已取得了一定的進展。

Mantafounis[57]等利用凝乳酶局部氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中天冬氨酸活性中心周圍的殘基對底物裂解的速率及反應(yīng)最適PH的影響，通過寡核苷酸突變將設(shè)計好的突變體導(dǎo)入至凝乳酶B中的cDNA中，利用pCT70在大腸桿菌中成功表達產(chǎn)生的凝乳酶突變體最適PH朝堿性偏移，并對其底物特異性造成了一定影響。Suzuki等[58]等人用17種氨基酸替換了微小毛霉所產(chǎn)凝乳酶中的Tyr-75，替換氨基酸為Asn時，酶的催化效率顯著提高，替換氨基酸為Phe時，酶活性明顯下降，其他15個樣本幾乎無活性。Huang K等[59]對凝乳酶中存在的二硫鍵與其性質(zhì)的聯(lián)系進行了研究，實驗結(jié)果表明：位于Cys250-Cys283的二硫鍵對于凝乳酶的正確折疊與催化活性是必需的。

隨著研究程度的進一步加深，人們可預(yù)見通過蛋白質(zhì)工程定向設(shè)計與改造生產(chǎn)具有需怡特性的微生物凝乳酶，并結(jié)合相關(guān)技術(shù)手段將其大規(guī)模應(yīng)用于食品行業(yè)。

5 總結(jié)及展望

自1961年以來，世界干酪產(chǎn)量大約增加了3.5倍，而小牛皺胃酶供應(yīng)量卻呈下降趨勢[60]。目前，世界小牛皺胃酶供應(yīng)量僅能滿足全球干酪產(chǎn)量的20%～30%。面對凝乳酶資源短缺、傳統(tǒng)小牛皺胃凝乳酶帶來的宗教文化矛盾，使得微生物凝乳酶的研究成為乳品科學(xué)領(lǐng)域近年來的熱點之一。

得益于近代生物技術(shù)的進步，人們可以更好的了解利用微生物這一寶藏；不僅可以更加快速便捷地發(fā)現(xiàn)新的微生物，并且可以按需求對其進行改造。但即使在這樣的環(huán)境下，對于微生物凝乳酶而言，還有很長的一段路要走，現(xiàn)階段真正運用于工業(yè)化酶制劑及干酪制作的微生物凝乳酶無論是種類還是功能均不盡如人意，擺在研究人員面前的難題依然很多，包括如何平衡干酪中蛋白質(zhì)的水解程度、低成本的發(fā)酵及純化分離方法、以及如何滿足不同要求的生產(chǎn)工藝等；但微生物凝乳酶這一食品資源的潛力是毋庸置疑的。推動新型微生物凝乳酶及相關(guān)乳制品的研究開發(fā)，不僅有利于乳品領(lǐng)域中酶制劑創(chuàng)新水平的提高，也能將科研成果更好地反哺市場，對促進我國乳品行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。