高效液相色譜法測定馬乳中維生素C的質(zhì)量濃度

聶昌宏，古麗巴哈爾·卡吾力，鄭欣，阿依居來克·卡得爾，高曉黎

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊830011）

0 引 言

維生素C又稱為抗壞血酸，具有抗壞血病的作用。嬰兒配方奶粉是嬰兒重要的維生素C來源，一旦缺乏維生素C，則會引起孩子幼年期壞血病的發(fā)生[1]，因此維生素C也是配方奶粉中需要強(qiáng)化的指標(biāo)之一[2]。

研究證明，馬乳和馬乳制品有豐富的營養(yǎng)價值，維生素C含量較高，是最佳食品之一[3]。

常見的維生素C檢測方法有：2,4—二硝基苯肼比色法[4]、紫外分光光度法[5]、碘量法[6]、2,6—二氯靛酚法等[7]。這些方法特異性較差，容易產(chǎn)生誤差。高效液相色譜法樣品預(yù)處理簡單、分離度高、分析時間短。本研究旨在建立一種快速檢測乳品中維生素C的高效液相色譜法，并運(yùn)用于各種乳中維生素C含量的測定，進(jìn)而對不同乳中維生素C含量及不同季節(jié)馬乳中維生素C含量進(jìn)行比較。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Agilent 1220型高效液相色譜儀，AB135-S型分析天平，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，Sigma3-K30型高速臺式冷凍型離心機(jī)，PS-1000型EYELA磁力攪拌恒溫油槽。

1.2 材料與試劑

偏磷酸（分析純），維生素C對照品（HPLC≥98%），馬乳粉（由鮮馬乳直接冷凍干燥制得）；鮮馬乳，鮮牛乳，鮮駝乳。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為SupersilAQ-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為0.125%偏磷酸溶液，流速為0.8 mL/min，檢測坡長為245 nm，進(jìn)樣量為10 μL，檢測器為紫外檢測器。

1.3.2 溶液配制

（1）流動相用偏磷酸溶液（0.125%）：取適量偏磷酸塊狀固體敲打研磨至粉末狀，精密稱取3.57 g于燒杯中，加入適量超純水，用磁力攪拌器在85℃熱水浴中攪拌，溶解后放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，以0.22 μm水系濾膜濾過，超聲10 min，待用。

（2）提取試劑用偏磷酸溶液（3%）：精密稱取上述偏磷酸粉末17.14 g于燒杯中，加適量超純水，用磁力攪拌器在85℃熱水浴中攪拌，溶解后放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.3 維生素C對照品的配制

精密稱取3.2 mg維生素C對照品于10 mL棕色容量瓶中，用3%偏磷酸溶液配制成質(zhì)量濃度0.32 mg/mL的儲備液定容，倍量稀釋成160，80，40，20，10，5，2.5 μg/mL系列質(zhì)量濃度對照品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 樣品處理

稱取0.4 g馬乳粉（液體乳2 g）于10 mL的棕色容量瓶中，加入3%偏磷酸溶液搖勻，定容，超聲10 min，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，濾液待上機(jī)檢測。

1.3.4 系統(tǒng)適用性驗(yàn)證

分別取對照品溶液和供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，理論塔板數(shù)按照維生素C計(jì)算應(yīng)不低于5 000。待測成分與相鄰峰之間分離度，拖尾因子需滿足測定需要。

分別取空白溶液1（0.125%偏磷酸）、空白溶液2（3%偏磷酸）、維生素C對照品溶液、樣品溶液在上述色譜條件下分析。

1.3.6 線性范圍

在上述色譜條件下，以1.3.3項(xiàng)下對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 精密度

取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算維生素C色譜峰峰面積的RSD，評價儀器精密度。

1.3.8 重復(fù)性

取同一批樣品，按照1.3.4項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)樣分析，計(jì)算馬乳粉中維生素C含量的RSD。

1.3.9 穩(wěn)定性

1）單一土地利用動態(tài)度，定量描述了區(qū)域一定時間范圍內(nèi)某種土地利用類型變化的速度［10］，其值越大，說明區(qū)域土地利用變化越劇烈，反之變化越弱。圖1為巢湖流域單一土地利用動態(tài)變化圖。

取同一供試品溶液，4℃及室溫下放置，分別于0，1，2，4，6，8 h；在上述色譜條件下，進(jìn)樣分析，計(jì)算8 h維生素C色譜峰峰面積變化程度。

1.3.10 準(zhǔn)確度

稱取對照品2.19 mg于25 mL容量瓶中，用3%偏磷酸定容。稱取已知含量的同批馬乳粉樣品9份，每份約0.2 g，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加3%偏磷酸溶液適量，使乳粉分散均勻，分別吸取上述對照品儲備液0.5，1，1.5 mL加入樣品容量瓶中，超聲10 min，用3%偏磷酸定容，制成高、中、低三個濃度的供試品溶液，每個濃度3份，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，濾液上機(jī)檢測，回收率為

1.3.11 樣品檢測

（1）不同季節(jié)馬乳中維生素C含量的測定：分別于4月、7月、12月從新疆伊犁新源縣各采集10個鮮馬乳樣品，馬乳采集后迅速降溫處理，-20℃保存，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)基地，實(shí)驗(yàn)前，先將樣品放置4℃緩慢融化，后于室溫下完全溶解，按照1.3.4的方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣，按照1.3.1條件上機(jī)檢測，外標(biāo)法定量。

（2）不同乳中維生素C含量的測定：分別取鮮馬乳、鮮牛乳、鮮駝乳的常乳樣本在1.3.4的方法下進(jìn)行操作，每個樣平行操作兩次，按照1.3.1條件上機(jī)檢測，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相比例的選擇

本研究比較了0.25%和0.125%兩種濃度的偏磷酸作為流動相，有學(xué)者采用0.25%的偏磷酸作為流動相[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較低濃度的偏磷酸也完全能夠達(dá)到檢測要求。本課題選擇較低濃度的偏磷酸作為流動相能夠減少對色譜柱的消耗；偏磷酸相較于其他試劑，具有一定的粘性，降低其濃度，可以減少其在色譜柱中的殘留。

2.1.2 流速的選擇

本研究比較了0.6，0.8，1 mL/min三種流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低流速會使出峰時間后移、分析時間延長；本文柱溫較低，如果選用較高流速，會明顯增高柱壓，本研究選擇0.8 mL/min的流速具有良好的分離效果，且保留時間適中。

2.2 樣品前處理方法的選擇

由于維生素C為水溶性物質(zhì)，故不宜使用經(jīng)典有機(jī)試劑提取法。實(shí)驗(yàn)前期比較了濃度為0.1 mol/L鹽酸提取法、調(diào)節(jié)pH法、偏磷酸的除蛋白法后發(fā)現(xiàn)，前兩種處理方法經(jīng)離心后上清液仍然較為渾濁，很難通過微孔濾膜；使用3%的偏磷酸作為蛋白沉淀劑，離心后能夠輕易通過微孔濾膜，上清液清澈，達(dá)到進(jìn)樣要求。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性實(shí)驗(yàn)

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，色譜峰理論塔板數(shù)大于10 000，分離度大于1.5，拖尾因子符合規(guī)定；專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照品和供試品維生素C目標(biāo)峰出峰時間一致，且周圍無測定干擾，如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4線性和范圍

在上述色譜條件下，以對照溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程為y=730 547.73x-775 998.67；r=0.9999，VC質(zhì)量濃度和峰面積在2.5～160 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度

精密度實(shí)驗(yàn)計(jì)算維生素C色譜峰峰面積的RSD為0.73%，結(jié)果表明，儀器精密度良好，見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示，6份供試品溶液測得維生素C中RSD為1.10%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，見表2。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，4℃下樣品8 h內(nèi)含量的RSD值為1.92%，室溫下樣品8 h內(nèi)含量的RSD值為3.58%，表明該方法在兩種條件下穩(wěn)定性均可，但在4℃條件下測定穩(wěn)定性更好，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 準(zhǔn)確度

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中、低三個水平的加標(biāo)回收率在95.8%～97.6%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.03%～1.56%之間。表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

2.9 不同泌乳期馬乳中維生素C含量的測定

維生素C含量測定結(jié)果如表5所示。

表5 不同季節(jié)馬乳中維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù) μg/g

由表5可以看出，夏季和冬季馬乳中維生素C平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)比春季高。夏季平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)比春季高75.42%，冬季平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)比春季高78.88%。夏季馬匹主要以放牧的飼養(yǎng)方式為主，此時牧草正處于抽莖開花時期，營養(yǎng)價值較高，馬匹能夠從牧場獲得較為充分的牧草營養(yǎng)，有助于馬匹的生長發(fā)育；冬季馬匹主要以圈養(yǎng)方式為主，以飼料和夏季打收的牧草為食，該階段天氣轉(zhuǎn)涼，馬乳中成分含量可能會受到溫度變化的影響；春季在新疆伊犁，馬匹需要經(jīng)過長達(dá)5～6個月漫長冬季，身體較為虛弱，此階段牧草正處于萌發(fā)期，營養(yǎng)相對不足，且春季是馬匹集中產(chǎn)駒的季節(jié)，此時所采馬乳多為馬初乳，馬匹在此時的生理狀態(tài)可能也是導(dǎo)致其馬乳中維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較低的原因。

2.10 不同乳中維生素C含量的比較

維生素C含量測定結(jié)果如表6所示。

表6 不同乳中維生素C質(zhì)量分?jǐn)?shù) μg/g

由表6可以看出，與表5馬常乳相比較，鮮牛乳和鮮駝乳中維生素C的含量遠(yuǎn)不及鮮馬乳，馬乳中維生素C含量相當(dāng)于鮮牛乳的68倍，相當(dāng)于鮮駝乳的35倍。馬奶對于草原上的人來說意義深遠(yuǎn)，飲用馬奶可以維持人體維生素的平衡，以免因?yàn)槿狈S生素C而導(dǎo)致壞血病的發(fā)生。有文獻(xiàn)記載，維生素C除了具有抗壞血病的作用，同時還具有抗氧化[9]，抗腫瘤[10]，免疫調(diào)節(jié)[11]等作用，馬乳中豐富的維生素C使其成為應(yīng)用價值較高的乳品。

3 結(jié) 論

本文建立了一種檢測乳品中維生素C含量的快速檢測方法，并對不同季節(jié)伊犁馬馬乳中維生素C含量以及不同乳中維生素C含量進(jìn)行了比較。該方法在2.5～160 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999；高、中、低三個濃度水平的加標(biāo)回收率在95.8%～97.6%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.03%～1.56%之間。該方法簡便、迅速；流動相不使用有機(jī)試劑，相對更為環(huán)保；方法適用廣泛，對鮮牛乳和鮮駝乳同樣適用。在不同季節(jié)馬乳的比較中，夏季和冬季的馬乳維生素C含量相對春季明顯更高；不同乳的比較中，馬乳中的維生素C含量明顯高于鮮牛乳和鮮駝乳。