高酮體乳的蛋白熱穩(wěn)定性研究

陳芮，彭鑫，吳雨薇，周青，溫富勇，王天坤，毛學英

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

0 引 言

奶牛酮病又稱酮血癥、酮尿癥，是碳水化合物及脂肪代謝紊亂所引起的一種營養(yǎng)代謝性疾病。酮病的發(fā)生與奶牛能量負平衡及體脂動員有關，會引起體組織和乳中酮體含量的升高[1]。一般認為當成年奶牛血液中β-羥丁酸濃度≥1.2 mmol/L時為亞臨床性酮病，當β-羥丁酸濃度＞3.0 mmol/L時為臨床性酮病[2-3]。酮病的發(fā)生導致奶產(chǎn)量大幅度降低、乳質(zhì)變差、乳成分改變、繁殖率降低及淘汰率升高等問題[4-5]。

在患酮病時，奶牛的平均產(chǎn)奶量顯著降低，且患酮病牛乳的成分較未發(fā)生酮病時會發(fā)生明顯變化。奶牛酮體升高時，牛乳非脂乳固體減少0.28%，乳糖和礦物質(zhì)降低0.19%，蛋白質(zhì)含量降低0.09%[5-6]，牛乳脂肪和蛋白的比值明顯升高[7-8]。Kayano等人通過T-檢驗和回歸分析研究了酮病對奶牛產(chǎn)奶量和乳成分的影響，發(fā)現(xiàn)酮病會導致產(chǎn)奶量下降和脂肪與蛋白質(zhì)的比值升高[9]。

奶牛酮病是一種在牧場中較為常見的營養(yǎng)代謝性疾病，目前國內(nèi)外關于酮病的研究多限于對酮病的預防和治療等，缺乏關于高酮體乳與正常乳營養(yǎng)成分差異的全面系統(tǒng)性評價，且尚未見關于高酮體乳加工特性的研究。因此，為了更好地探究高酮體乳的加工特性，本文探究了不同酮體濃度的牛奶熱穩(wěn)定性，為牧場的生產(chǎn)管理和乳品加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常乳（normal milk，NM）和高酮體乳（high ketone milk,HKM）取自北京密云河南寨牧場。5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇（β-ME）、溴酚藍、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍等為超級純。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

BS124s分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；L2102電子天平，伯拉莫貝林（上海）；UV-2600紫外-可見分光光度計，尤尼克（上海）儀器有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；552BR電泳儀，Bio-RAD；RF-5301PC熒光分光光度計，日本島津有限公司；DSHZ-300A恒溫水浴振蕩器，江蘇太倉實驗設備廠；TG16W高速臺式離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；QL-861漩渦振蕩器，海門市其林貝爾實驗設備制造有限公司；SC-3612低速離心機，安徽中科佳科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

取正常乳（NM）和高酮體乳(HKM，酮體含量1.6 mmol/L)，向兩種乳中添加質(zhì)量濃度0.02%的疊氮化鈉，置于4℃保存。

將正常乳和高酮體乳分裝至試管中，每管4 mL。分別在65、75、85、95 °C下加熱10 min。取出后立即冰浴2 min，恢復至室溫。

1.3.2 SDS-PAGE電泳

根據(jù)Emmanulled的方法并稍加改動[10]。樣品用去離子水稀釋后，與一定體積的樣品緩沖液混勻后，沸水浴5 min，冷卻后搖勻上樣10 μL。樣品緩沖液分別是SDS還原緩沖液（質(zhì)量分數(shù)10%的SDS，濃度為14.4 mol/L的β-巰基乙醇，質(zhì)量分數(shù)25%甘油，0.1%溴酚藍，濃度為 60 mmol/L的 Tris-HCl，pH值 為6.8）和SDS非還原緩沖液（同上，不含巰基乙醇）。分離膠質(zhì)量分數(shù)為12.5%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)5%。考馬斯亮藍染色后脫色到背景色很淡為止，用Canon掃描儀掃描。

1.3.3 乳清蛋白變性程度

參考Leighton的方法，并稍作改變[11]。取經(jīng)熱處理后的牛乳5 mL，每管中加入2 g NaCl，37°C水浴加熱30 min（前15 min以100 r/min的速度震蕩，后15 min靜置）。然后取出，趁熱過濾到10 mL離心管中。取1.8 mL濾液于另一個離心管中，加入4 mL飽和NaCl溶液混合制成濾液鹽，倒置蓋塞振搖，而后加入5滴10%的HCl，靜置10 min，以不加濾液的鹽溶液做空白，420 nm處測吸光值。每個樣品做三個平行。

1.3.4 巰基含量

根據(jù)Beveridge et al的方法并稍作修改，測定乳的巰基含量[12]。取1 mL樣液＋5 mL緩沖液I＋0.04 mL Ellman試劑于10 mL離心管中，混充分勻后置于25°C恒溫保持10 min。然后取約2～3 mL樣品置于玻璃比色皿中，采用分光光度計測定樣品在412 nm處的吸光值。不加樣液時作為空白調(diào)吸光度為0。

巰基含量按照公式進行計算：

式中：A412—樣品在412 nm處的吸光值

D—稀釋倍數(shù)D=6.04×2=12.08

C—樣品固形物含量mg/mL

1.3.5 表面疏水性

根據(jù)Alizadeh-Pasdar and Li-Chan的方法并稍作修改[13]。樣品熱處理后用pH值為7.0濃度為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋，使樣品液的蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.0025%～0.0125%。取1 mL上述稀釋蛋白液，加入4 mL水稀釋，漩渦振蕩，充分混勻。加入ANS后混勻避光靜置10 min，然后用熒光分光光度計下分析，激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm左右測定熒光強度F1，同時測定不加ANS探針時的內(nèi)源性熒光強度F0。以蛋白質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，相對熒光強度（F1與F0的差值）為縱坐標，得到曲線的初始斜率即為表面疏水性。

2 結果分析與討論

2.1 正常乳和高酮體乳的蛋白電泳圖譜分析

未經(jīng)熱處理的正常生乳和高酮體生乳的非還原電泳圖譜如圖1所示。

圖1 正常乳和高酮體乳的電泳圖譜

從電泳圖來看，在上樣量相同時，高酮體乳的β-CN、κ-CN、α-LA條帶顏色更深，寬度更寬，說明高酮體乳的β-CN、κ-CN、α-LA比例高于正常牛乳。而對α-CN、LF、BSA，兩種乳之間的條帶并不存在肉眼可見的差異。

2.2 熱處理對乳清蛋白變性程度的影響

經(jīng)過65，75，85，95 °C分別熱處理10 min后，乳清蛋白變性程度結果如圖2示。

圖2 不同溫度下乳的乳清蛋白變性程度（*P<0.05）

根據(jù)乳清蛋白氮指數(shù)原理，OD420可表征乳清蛋白變性程度，OD值越高，蛋白變性程度越低。對比兩組乳樣可知，在加熱溫度到達65°C時，兩組乳的OD值略有增加，可能是溫度升高促進了蛋白溶解所致。在溫度不高于75°C時，未變性乳清含量并未發(fā)生明顯變化，乳蛋白均未發(fā)生明顯的熱變性。當溫度達到85°C和95°C時，乳樣的吸光值均顯著下降，說明樣品中的蛋白都發(fā)生了一定程度的變性，且正常乳的OD值顯著高于高酮體乳，說明正常乳的變性程度顯著低于高酮體乳。隨著熱處理強度的進一步增強，OD值逐漸減小，說明未變性乳清蛋白的含量顯著減少。乳清蛋白在熱處理過程中暴露活性巰基，活性巰基通過二硫鍵形成小聚集體，當熱處理強度進一步增加時，小聚集物通過二硫鍵和疏水相互作用結合形成較大的聚集體。在加熱過程中（85°C、95°C），正常乳呈現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。

2.3 熱處理對乳蛋白表面巰基含量的影響

樣品經(jīng)65，75，85，95 °C分別熱處理10 min后，樣品表面巰基變化如圖3所示。

圖3 不同溫度下的表面巰基含量（*P<0.05）

樣品經(jīng)65°C熱處理10 min與25°C熱處理10 min的樣品相比，表面巰基沒有明顯變化。當熱處理強度增強至75°C時，高酮體乳的表面巰基含量明顯升高，并在95°C時達到最大，且顯著高于25°C時的表面巰基含量。將高酮體乳與正常牛乳的表面巰基對比，發(fā)現(xiàn)溫度達到85°C時，高酮體乳和正常牛乳的表面巰基顯著增加，且高酮體乳的表面巰基含量高于正常牛乳。當溫度達到95°C時，兩種原料的表面巰基含量進一步增大，蛋白質(zhì)變性程度增加。綜上分析可知，高酮體乳蛋白熱穩(wěn)定性較正常牛乳差。高溫處理時，β-LG變性，分子鏈展開，內(nèi)部隱藏的巰基暴露，表面巰基含量增加[14]。

2.4 熱處理對乳蛋白表面疏水性的影響

樣品經(jīng)65，75，85，95 °C分別熱處理10 min后，乳蛋白疏水性變化如圖4所示。

總體來看，乳蛋白的疏水性均隨溫度升高而升高，且在95°C時達到最高。在加熱溫度為75°C、85°C、95°C時，高酮體乳蛋白的表面疏水性均顯著大于正常牛乳，說明在高溫處理下，高酮體乳蛋白發(fā)生了更為顯著的變性。溫度升高會使乳中的疏水性位點增加，在85°C和95°C下，乳蛋白發(fā)生發(fā)生比較顯著的變性，疏水性位點也逐漸增加。蛋白間的疏水相互作用與蛋白的二級結構和三級結構有緊密聯(lián)系，疏水性互作用降低，則說明蛋白分子的二三級結構水平較高[15]。

圖4 不同溫度下乳的表面疏水性（*P<0.05）

2.5 乳蛋白SDS-PAGE電泳圖譜隨加熱強度的變化

對不同熱處理的高酮體乳和正常牛乳進行電泳分析，結果如圖5所示。

圖5 不同溫度下的正常乳與高酮體乳電泳圖

在非還原條件下，發(fā)現(xiàn)對于高酮體乳來說，當加熱溫度為65°C時，乳清蛋白條帶開始變淺，說明此時部分乳清蛋白發(fā)生了變性，但還沒有明顯的聚集物產(chǎn)生；當熱處理溫度升至75°C時，加樣孔中開始有聚集物出現(xiàn)，同時酪蛋白條帶變淺、乳清蛋白尤其是α-乳白蛋白條帶變淺，且隨著溫度的繼續(xù)升高，程度加劇；當加熱溫度達到95°C時，酪蛋白條帶和乳清蛋白條帶明顯變淺，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白條帶幾乎完全消失；這說明當溫度達到75°C及以上時，乳清蛋白自身或酪蛋白與乳清蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，形成明顯的聚集物。

還原條件下，加入β-巰基乙醇還原二硫鍵后，65°C、75°C熱處理樣品的加樣孔蛋白聚集物完全消失，且乳清蛋白條帶及酪蛋白條帶恢復至與25°C處理樣品相當?shù)乃?；熱處理溫度?5°C的樣品加樣孔蛋白聚集物完全消失，但乳清蛋白（尤其是α-乳白蛋白）條帶稍淺；熱處理溫度為95°C的樣品加樣孔中仍有聚集物，且乳清蛋白（尤其是α-乳白蛋白）條帶也比25°C樣品淺。這說明對于兩種乳來說，熱處理過程中，蛋白主要通過二硫鍵作用形成聚合物，但當溫度較高（85°C、95°C）時，蛋白的聚集可能有其他作用力的參與，如疏水相互作用等。從電泳結果來看，高酮體乳的熱穩(wěn)定性更差。

3 結 論

兩種乳在75°C～95°C處理下下均發(fā)生一定程度的變性，在溫度達到75°C時，高酮體乳已經(jīng)發(fā)生變性，電泳加樣孔中出現(xiàn)少許聚集物，而正常牛乳未發(fā)生明顯變性。在溫度達到85°C和95°C時，兩種乳均發(fā)生明顯變性，但是高酮體乳的變性程度更高，熱穩(wěn)定性更差。