聚丙烯腈膜固定化海藻糖合成酶的研究

婁倩芳 ，李由然 ，石貴陽 *

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

海藻糖，是由兩個吡喃型葡萄糖單體通過α，α-1，-1糖苷鍵連結而成的非還原型二糖，分子式為C12O22H11。廣泛存在于細菌、霉菌、藻類、酵母、低等植物以及一些無脊椎動物等[1]，具有獨特的生物抗逆保護作用以及低甜度、非還原性等，在分子生物學、食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)等各個領域應用廣泛[2-8]。

海藻糖生產方法主要有化學合成法、微生物抽提法、微生物發(fā)酵法、酶法等[4]，其中雙酶法生產海藻糖是目前工業(yè)化生產海藻糖的主要方法。但存在酶需要精制、反應中間產物多、產物分離提取過程復雜等問題，而海藻糖合成酶能夠以廉價的麥芽糖為底物一步生成海藻糖，工藝簡單、底物價廉、易于調控等特性，是工業(yè)化生產海藻糖的可行性方案。但是，依然存在酶制備工藝復雜、游離酶穩(wěn)定性差、不能重復利用、與底物分離困難等不足，可以結合固定化技術解決這些問題。目前國內外固定化海藻糖合成酶的報道中，以介孔分子篩[9]、細菌纖維素[10]、殼聚糖[11]、磁性 Fe3O4納米材料[12]、Eupergit C250L 為載體[13]、多孔聚苯乙烯離子交換樹脂[14]為載體進行海藻糖合成酶的固定化研究，解決了固定化酶操作穩(wěn)定性、轉化率等問題，但依然存在固定化酶制備周期長、方法重復性差以及副產物含量高等問題。

聚丙烯腈（Polyacrylonitrile PAN）是指由85%以上丙烯腈與第二、第三單體聚合而成的高聚物[15]，具有易成膜、抗菌性、成本低以及良好的物理化學穩(wěn)定性等優(yōu)點，常用作工業(yè)化生產分離膜材料。同時，利用聚丙烯腈纖維上的多孔性以及弱酸性基團如羧酸根、磺酸根等[16]可以進行吸附染色。本實驗參考聚丙烯腈纖維吸附染色原理，以聚丙烯腈膜為載體，旨在以成本低、操作簡便、無污染的固定化方法和材料，獲得具有良好酶學特性的固定化酶，同時探討固定化酶反應中副產物葡萄糖含量的變化，為海藻糖合成酶新固定化材料提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種E.coliBL21（DE3）/pET-28a（+）-TreS：由本實驗室構建。

1.1.2 主要試劑聚丙烯腈粉末：上海金山石化公司；N，N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇（PEG-400）、十二水合磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、海藻糖、麥芽糖、葡萄糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：Sigma—Aldrich 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基TB培養(yǎng)基：蛋白胨 12 g，酵母粉 24 g、K2HPO412.54 g、K2HPO42.31 g，甘油 5 g，去離子水定容到1 L。

1.2 儀器與設備

臺式高速冷凍離心機，Hitachi公司；Sonic VCX-750超聲波細胞破碎儀，南京新晨生物科技有限公司；紫外-可見光分光光度計V-1200，上海美譜達儀器有限公司；AL104分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；高效液相色譜系統(tǒng)及工作站，DIONEX公司。

1.3 方法

1.3.1 PAN膜制備在250mL藍蓋瓶中加入55 mL二甲基甲酰胺、5 mL聚乙二醇400，輕輕混勻，加入聚丙烯腈粉末10 g，攪拌均勻，加蓋子擰緊，放置65℃烘箱中反應，48 h后，觀察成黃色均勻粘稠液體。于室溫下放置24 h，除去氣泡。倒入具有0.44 mm深度槽的玻璃板上，用玻璃棒刮膜，并立即將玻璃板放入去離子水中，形成薄膜后，將薄膜放置于新的去離子水中24 h以上，中間換3次水，即得聚丙烯腈膜材料。

1.3.2 游離酶液制備將菌種接種到30 mL TB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖瓶至 OD600值為 0.6，加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L于25℃、200 r/min條件下發(fā)酵18 h。所得發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min收集菌體，用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液清洗后重懸，超聲破碎制備粗酶液，超聲后酶液離心取上清，即得海藻糖合成酶液。

1.3.3 海藻糖合成酶固定化取制備好的PAN膜于燒杯中，加入去離子水超聲處理（功率：100 W，頻率：40 kHz）20 min 后，去除表面水分，取 30 cm2面積的膜，裁剪為0.5 cm2面積，放置于50 mL離心管中，加入3 mL磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液制備的海藻糖合成酶液（蛋白濃度：1.85 mg/mL），在25℃水浴中吸附反應3 h后，用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液清洗載體，除去表面附著的游離酶，離心、抽濾即得固定化海藻糖合成酶膜。

1.3.4 海藻糖、麥芽糖、葡萄糖標準曲線制作高效液相色譜法分析海藻糖含量：色譜柱為XBridge Amide 氨基柱（5 μm×250 mm×4.6 mm），視差檢測器，流動相為乙腈∶水=80∶20，流速 1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為37℃，根據(jù)海藻糖標準曲線，求出樣品中海藻糖的含量。

1.3.5 蛋白含量與酶活測定采用考馬斯亮藍法測蛋白含量[17]。

固定化蛋白量（mg）=加入總蛋白量（mg）-清洗液上清中蛋白量（mg）。

固定化蛋白率（%）=負載蛋白量（mg）/加入總蛋白量（mg）×100%。

游離酶酶活測定：取制備的游離酶液稀釋一定的倍數(shù)后，取1 mL于50 mL離心管中，加入8 mL 5%的麥芽糖底物，30℃條件下反應12 h，沸水浴煮沸10 min終止反應，離心、過膜后，采用高效液相色譜（HPLC）法測定反應液中海藻糖含量。

固定化酶酶活測定：取一份固定化酶，加入8 mL一定濃度的麥芽糖底物，在一定溫度下反應12 h，沸水浴煮沸10 min終止反應，離心過膜后，采用HPLC法測定反應液中海藻糖含量。

酶活單位定義：在以上反應條件下每分鐘生成1 μmol海藻糖為一個單位酶活。

比酶活：反應總的酶活與酶總蛋白含量的比值。

相對酶活定義：以反應條件中酶活最大的反應為100%，計算其余反應酶活相對百分比。

相對比酶活定義：以反應條件中比酶活最大的反應為100%，計算其余反應比酶活相對百分比。

酶活回收率定義：固定化酶總活力/加入酶的總活力×100%。

1.3.6 固定化條件優(yōu)化方法取30 cm2面積的膜，裁剪為0.5 cm2面積，放置于50 mL離心管中，依次考察在：pH 5.4～8.0的酶液 （蛋白濃度：1.85 mg/mL），10～45 ℃震蕩水浴， 吸附反應時間 0.5～5.0 h、給酶量0.04～0.42 mg/cm2等不同條件，測量固定化蛋白量和固定化酶總酶活，考察pH對固定化效果的影響，選擇最佳固定化pH、溫度、吸附時間、給酶量。

1.3.7 固定化酶學性質分析方法在最佳固定化條件下制備固定化酶，取相同面積的固定化酶膜以及相同蛋白含量的游離酶，依次考察在：pH 5.4～8.0的5%（w/v）麥芽糖底物、20～60℃、麥芽糖底物質量濃度 50～350 g/L 以及 Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等不同金屬離子溶液的條件下的總酶活，分析固定化酶最適反應pH、溫度、初始底物濃度、抑制劑和激活劑等酶學特性。

2 結果與討論

2.1 固定化條件對固定化效果的影響

2.1.1 酶固定化過程pH對固定化效果的影響取pH 5.4～8.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液制備的酶液（蛋白濃度：1.85 mg/mL），在25℃震蕩水浴鍋中吸附反應3 h，考察pH對固定化酶活性的影響，結果見圖1。

由圖1所示，隨著pH值的升高，固定化酶活性逐漸升高，在pH 7.6時酶活最高；比酶活在pH 7.4后急劇下降。由于PAN材料上帶有弱酸性基團，pH較低時影響弱酸性基團的電離，所以，偏堿性的環(huán)境有利于酶分子中氨基與PAN載體上的羧酸基結合，因此選擇最佳固定化反應pH為7.6。

圖1 酶固定化過程pH對固定化效果的影響Fig.1 Effect of immobilized pH on immobilized enzyme

2.1.2 固定化溫度對固定化酶酶活的影響取相同的PAN膜載體在pH 7.6條件下，分別在10、25、30、35、40、45 ℃震蕩反應 3 h，制備固定化酶，測定固定化反應溫度對固定化酶的影響，結果見圖2。

如圖2所示，隨著固定化溫度的升高，固定化酶酶活逐漸升高，在35℃時酶活性最高，隨著溫度的繼續(xù)升高固定化酶酶活性急劇下降；固定化酶比酶活隨著溫度的升高先升高后急劇下降，在30℃時比酶活達到最大。由此可知，隨著溫度的升高，偶聯(lián)到載體上的蛋白含量增多，同時由于游離酶對溫度的敏感性，溫度的改變使酶的空間構象發(fā)生變化，導致酶活性的變化。因此，綜合考慮，選擇30℃作為固定化溫度。

圖2 固定化溫度對固定化酶的影響Fig. 2 Influence of immobilized temperature to immobilized enzyme

2.1.3 固定化時間對固定化酶活的影響取相同膜面積PAN載體，在pH 7.6、溫度30℃條件下，加入3 mL酶液，在相同條件下分別固定化0.5～5.0 h，通過測量不同不固定化時間條件的見固定化蛋白量和固定化酶總酶活，考察固定化時間對固定化酶的影響，結果見圖3。

如圖3所示，隨著固定化時間的延長，固定化酶活逐漸增加，并逐漸平穩(wěn)；而相對比酶活先增加后逐漸降低，由此可知，隨著固定化時間的延長，載酶量逐漸增加，酶活趨于穩(wěn)定，說明酶分子開始從表層擴散進入載體空隙內，但有效酶僅與載體表面積有關。因此，選擇固定化時間為3.0 h。

圖3 固定化時間對固定化酶的影響Fig.3 Influence of immobilized time to immobilized enzyme

2.1.4 固定化加酶量對固定化酶活的影響取相同膜面積PAN載體，在pH 7.6、溫度30℃條件下，分別加入0.04～0.42 mg/cm2的酶液，固定化反應3 h，考察加酶量對固定化酶的影響，結果見圖4。

如圖4所示，隨著加酶量的逐漸增大，固定化酶活逐漸增大最后基本不變，而相對比酶活呈逐漸下降的趨勢，由此可知，固定化酶有效載酶量僅與膜表面積有關。因此，選擇最適加酶量為0.1 mg/cm2。

圖4 固定化加酶量對固定化酶的影響Fig.4 Influence of enzyme dosage to immobilized enzyme

2.2 固定化酶酶學性質分析

由以上實驗可知，最佳固定化條件為pH 7.6、溫度30℃、時間3 h、加酶量0.1 mg/cm2。

2.2.1 固定化酶最適反應pH在最佳固定化條件下制備固定化酶以及取相同偶聯(lián)蛋白含量的游離酶，分別加入不同pH緩沖液配制的底物，在25℃條件下反應12 h，采用HPLC法測定酶活。結果如圖5所示，固定化酶最適反應pH 7.4，與游離酶相比，固定化酶pH穩(wěn)定性在pH 5.4～8.2范圍均保持良好的穩(wěn)定性，說明經過固定化后，使得酶活性中心對環(huán)境pH的敏感性變弱，酶分子更加穩(wěn)定。

圖5 固定化酶與游離酶最適反應pH探討Fig.5 Research on the optimal reaction pH of the immobilized enzyme and the free enzyme

2.2.2 固定化酶最適反應溫度在最佳固定化條件下制備固定化酶以及取相同偶聯(lián)蛋白含量的游離酶，分別加入pH 7.4緩沖液配制的麥芽糖底物，分別在20～60℃之間反應12 h，采用HPLC法測定酶活。結果如圖6所示，固定化酶最適反應溫度為40℃，且在25～45℃范圍內均保持較高的酶活，相對于游離酶最適溫度30℃，最適溫度提高了10℃，且在50、60℃比游離酶耐熱性高，經過固定化后，酶的熱穩(wěn)定性得到提高。

圖6 固定化酶與游離酶最適反應溫度探討Fig.6 Research on the optimal reaction temperature of the immobilized enzyme and the free enzyme

2.2.3 固定化酶反應最適初始底物濃度在最佳固定化條件下制備固定化酶以及取相同固定化蛋白含量的游離酶，分別加入pH 7.4與pH7.0緩沖液配制的質量濃度為50～350 g/L梯度的麥芽糖底物，在40℃反應12 h，采用HPLC法測定酶活，結果如圖7所示。由圖7可知，固定化酶最適初始底物濃度為200 g/L，伴隨著底物濃度的升高，有略微的下降，推測，由于酶被固定在載體上，且底物濃度越高，底物流動性越差，從而影響固定化酶酶反應進程，游離酶最適初始底物濃度為25%，與文獻[18]的結果基本一致，說明采用聚丙烯腈膜為載體，傳質阻力較小。

2.2.4 固定化酶穩(wěn)定性在最佳固定化條件下制備固定化海藻糖合成酶，在pH 7.4、40℃、麥芽糖質量濃度200 g/L的條件下反應12 h，反應結束后，取出反應液煮沸10 min，用HPLC法測反應總酶活，將載體用pH 7.4的緩沖液進行清洗，除去表面水分，重復上述操作共15次，考察固定化酶的重復穩(wěn)定性，結果見圖8。

圖7 固定化酶與游離酶最適初始底物濃度探討Fig.7 Research on the optimalinitialsubstrate concentration of the immobilized enzyme and the free enzyme

結果如圖8所示，固定化酶隨著使用次數(shù)的增多，酶活逐漸下降，在最適反應溫度40℃條件下使用6次后，固定化酶活仍保持初始酶活的64.4%。

圖8 固定化酶40℃反應條件下重復使用穩(wěn)定性探討Fig.8 Research on the stability of immobilized enzyme reaction repeated use under 40℃

2.2.5 金屬離子對固定化酶的影響在最佳固定化條件下制備固定化酶，同時相同固定化酶含量的海藻糖合成酶酶液，分別加入200 g/L pH 7.4麥芽糖底物和25%pH 6.6麥芽糖底物，以及配制的10 mmol/L 濃度的 Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Al3+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+溶液，使得金屬離子終濃度為0.4 mmol/L，固定化酶與游離酶分別在40、30℃條件下反應12 h，用HPLC法測定酶活，以不加入金屬離子的反應為空白對照。結果如圖9所示。

結果表明，對于游離酶而言，Ni2+具有激活作用，Cu2+、Fe2+、Co2+均具有輕微的抑制作用，其余的金屬離子基本無影響；對于固定化酶而言，僅Cu2+均具有輕微的抑制作用，Ca2+、Zn2+具有激活作用，而其余的金屬離子對酶活基本無影響。說明固定化后酶的空間構象發(fā)生改變，金屬離子對酶的作用發(fā)生變化，固定化后提高了酶的穩(wěn)定性。

圖9 金屬離子對固定化酶以及游離酶的影響Fig.9 Influence of metal ions of immobilized enzyme and free enzyme

2.2.6 固定化效率取一定面積的PAN載體，在最佳固定化條件下制備固定化酶，計算蛋白偶聯(lián)率，并在最適反應條件下反應12 h；同時取進行固定化的等量游離酶液在pH 6.6、溫度30℃、初始底物濃度250 g/L的最適反應條件下反應12 h，采用HPLC法進行海藻糖含量的測定。經過3次平行實驗，蛋白負載率平均70.09%，而酶活回收率僅為50.21%，推測有3種可能性：①所接入的蛋白超過膜面積應接入的有效蛋白；②固定化載體負載上的蛋白部分失活；③負載的蛋白中，雜蛋白的比例高于游離酶液中的比例。

表1 固定化效率Table 1 Immobilization efficiency %

2.2.7 固定化酶與游離酶反應進程在最佳固定化條件下，分別制備相同的固定化酶膜，加入8 mL 200 g/L濃度的麥芽糖底物，在40℃、pH 7.4條件分別反應4～70 h；同時，取相同蛋白含量的游離酶液，加入8 mL質量濃度為250 g/L的麥芽糖底物，在30℃、pH 6.6條件分別反應4～70 h，取固定化酶和游離酶不同反應時間的反應液，沸水浴10 min，離心、過膜，用HPLC法測不同反應時間各個成分的含量。結果如圖10所示。

結果表明，對于固定化酶、游離酶而言，隨著反應時間的進行，海藻糖含量逐漸升高，伴隨著麥芽糖含量的降低以及副產物葡萄糖的增加，最終基本趨于穩(wěn)定狀態(tài)；相比之下，經過固定化后的海藻糖合成酶，海藻糖含量變化趨勢較游離酶的緩慢，同時副產物葡萄糖的含量較游離酶而言減少近6%左右，說明，經過固定化后的海藻糖合成酶，相對于游離酶，與底物的親和力受到影響，但相對于游離酶結構狀態(tài)更為穩(wěn)定，副產物葡萄糖含量減少。

圖10 固定化酶與游離酶反應進程曲線Fig.10 Reaction process curve of immobilized enzyme and free enzyme

3 結語

實驗表明，以PAN為載體進行海藻糖合成酶固定化，在pH 7.6、溫度30℃，加酶量0.1 mg/cm2條件下固定化3 h，即可制備固定化海藻糖合成酶膜，與文獻[9-14]的海藻糖合成酶的固定化而言，載體材料制備方法簡單、操作容易、易于控制、成本低、可規(guī)?；a，且固定化條件簡單、時間短、無污染等，同時，海藻糖合成酶固定化時使用粗酶液即可，無需純化。

根據(jù)研究表明，游離酶在pH 6.0～7.0、溫度25～40℃較穩(wěn)定，而固定化海藻糖合成酶在pH 5.4～8.0、20～50℃范圍內均保持良好的穩(wěn)定性，固定化酶具有更好的耐熱性和酸堿穩(wěn)定性；40℃條件下，固定化酶重復使用6次后保持初始酶活的64.4%，具有良好的操作穩(wěn)定性；固定化酶反應達到平衡后，反應液中副產物葡萄糖的含量僅為9.1%并呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，文獻[13]的固定化酶相比，副產物含量降低約23%，同游離酶相比降低6個百分點，固定化后海藻糖合成酶更加穩(wěn)定；固定化海藻糖合成酶與游離酶最適初始底物濃度分別為200 g/L與250 g/L，酶固定在載體上后，與底物之間的親和性相對于游離酶而言仍有一定的局限性，但相對于采用顆粒狀載體而言，以膜的形式進行酶的固定化，在很大程度上降低了載體對傳質的影響。

因此，以PAN作為載體為海藻糖合酶固定化具有很好的應用價值，為海藻糖合成酶的固定化研究提供實驗依據(jù)并拓展了PAN載體在酶固定化中的應用。