土壤細菌趨化性研究進展*

朱曉艷 沈重陽 陳國煒 張 偉 李保國 王 鋼?

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100083）（2 合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，合肥 230009）

土壤中的細菌常常主動利用自身特性進行取食并趨向有利（或躲避有害）環(huán)境。細菌的這種趨向有利化學(xué)物質(zhì)（引誘劑，正趨化作用）、規(guī)避有害化學(xué)物質(zhì)（驅(qū)避劑，負趨化作用）的本能簡稱為趨化性［1］。細菌趨化現(xiàn)象普遍存在于土壤生態(tài)系統(tǒng)中，受土壤物理、化學(xué)和生物因素的綜合影響。它調(diào)節(jié)土壤微生物多樣性及土壤養(yǎng)分的循環(huán)、轉(zhuǎn)化和分布等［2］，并在土壤污染生態(tài)防治及微生物過程修復(fù)等應(yīng)用研究中意義重大［3］。

自Pfeffer［4］發(fā)現(xiàn)細菌趨化性以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者就針對其展開了廣泛的研究，其中，土壤中細菌的趨化現(xiàn)象備受人們關(guān)注。但由于土壤本身具有難觀測性、空間異質(zhì)性和時空變化不穩(wěn)定等特性，土壤中細菌趨化性研究極具困難。近幾十年以來，熒光原位雜交技術(shù)、微流控技術(shù)和光學(xué)顯微技術(shù)的快速發(fā)展，為土壤細菌趨化性研究提供了技術(shù)支撐和光明的研究前景，極大地推動了其研究進程［5-7］。本文就國內(nèi)外有關(guān)土壤細菌趨化性的研究進展進行總結(jié)和探討，并就將來進一步的研究進行了展望，旨在為今后的相關(guān)研究提供一定的參考。

1 細菌趨化行為模式及信號傳導(dǎo)通路

由于自然環(huán)境異質(zhì)復(fù)雜，細菌進化了多種趨化行為模式以適應(yīng)其周圍微環(huán)境的變動［8-9］。趨化性是細菌在復(fù)雜異質(zhì)環(huán)境中尋找最佳化學(xué)環(huán)境的能力。當(dāng)細菌處于存在引誘劑梯度的飽和液體環(huán)境中時，細菌會通過調(diào)節(jié)自身鞭毛旋轉(zhuǎn)方向進行具有偏向性的趨化游動（swimming)；當(dāng)細菌位于含水粗糙表面時，細菌仍依賴鞭毛旋轉(zhuǎn)進行種群涌動（swarming）；而當(dāng)其處于固體界面時，細菌則依靠四型菌毛（type IV pili,TfP）的收縮或拉伸進行蹭行（twitching）［9］。下面簡要介紹上述三種細菌常見的趨化行為模式（游動、涌動和蹭行）及其相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路。

1.1 個體水平上的游動

細菌借助鞭毛旋轉(zhuǎn)在小雷諾數(shù)（約10-5）液體環(huán)境中游動［10］。前人以革蘭氏陰性周生鞭毛菌大腸桿菌（Escherichia coli）為模式菌株就細菌鞭毛結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)細菌游動的機制展開了深入研究［1,8,11-15］。Berg和Brown［11］利用3D跟蹤細胞軌跡顯微鏡分別追蹤E. coli在化學(xué)物質(zhì)均勻和存在梯度的飽和液體環(huán)境中的運動行為，發(fā)現(xiàn)E. coli在均勻液體環(huán)境中的運動類似于隨機游動（圖1A），包括近似直線的快速泳動（run）和突然轉(zhuǎn)向的翻滾（tumble）。E. coli直線運行的速度約20 μm·s-1、時間0.8 s左右，此時周生鞭毛（5～10根）合成一束、鞭毛束逆時針方向旋轉(zhuǎn)（從細胞體后面觀察）；E. coli突然轉(zhuǎn)向翻滾的時間約0.2 s，此時鞭毛束散開、順時針方向旋轉(zhuǎn)（從細胞體后面觀察）。當(dāng)細菌置身于引誘劑（或驅(qū)避劑）濃度梯度中時，其沿著引誘劑（或反向驅(qū)避劑）濃度梯度上直線運動的總時間增加，進而實現(xiàn)具有偏向性的趨化游動（圖1B）［11］。周生鞭毛菌一般執(zhí)行“泳動-翻滾”（run-tumble）運動形式，而極性鞭毛菌則進行“前進-后退”（forward-reverse）（如Shewanell aputrefaciens，Pseudoalteromonas haloplanktis，Vibrio coralliilyticus和Pseudomonas aeruginosa）或“前進-后退-跳轉(zhuǎn)”（forward-reverseflick）運動形式（如Vibrio alginolyticus）［12］。由于極性鞭毛菌不能像E. coli一樣通過周生鞭毛束的“分-合”實現(xiàn)重新定位，便進化了另一種機制，即通過單根鞭毛鉤的離軸變形（off-axis deformation）、短暫逆轉(zhuǎn)（brief reversal）來改變游動方向，不過極性鞭毛菌亦是通過增加沿著引誘劑梯度上的總運動時間而實現(xiàn)趨化游動的［12］。

圖1 飽和液體微環(huán)境中，趨化性細菌（E. coli）在無引誘劑梯度條件下的隨機游動（A）或引誘劑梯度條件下的趨化游動（B）Fig. 1 Random swimming of chemotactic bacteria (E. coli) in the absence ofchemoattractant gradient(A) or chemotactic swimming (B)in the presenceofchemoattractant gradientin saturated liquid microenvironment［11, 13］

E.coli整個趨化信號傳導(dǎo)通路由感受環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)濃度的跨膜趨化性受體蛋白MCP（Tar,Tsr, Trg, Tap, Aer）和細胞質(zhì)內(nèi)的六種調(diào)節(jié)蛋白（CheA, CheW, CheY, CheB, CheR和CheZ）參與，任何一個MCP和調(diào)節(jié)蛋白控制基因的突變或缺失均能致使細菌失去對特定引誘劑趨化信號的感知或傳遞能力，最終使細菌趨化功能受損或徹底喪失［14］。整體上，E. coli整個傳導(dǎo)通路由傳感模塊和運動模塊兩部分組成（圖2），兩模塊經(jīng)關(guān)鍵節(jié)點CheY蛋白連接［15］。一般情況下，有活性的CheA蛋白能夠進行自磷酸化，一旦CheA蛋白通過自磷酸化得到磷酸基團，則將其轉(zhuǎn)移給響應(yīng)調(diào)節(jié)器CheY蛋白，或者去甲基化激酶CheB蛋白。然后磷酸化的CheY蛋白在細胞質(zhì)中擴散并結(jié)合細胞膜上的鞭毛馬達，促進鞭毛順時針旋轉(zhuǎn)［16］。而引誘劑小分子與受體蛋白的結(jié)合，會抑制CheA蛋白自磷酸化，降低鞭毛馬達順時針轉(zhuǎn)動比率，從而增加細菌向高濃度引誘劑直線運動的時間，最終實現(xiàn)具有偏向性的隨機游動［17］。

雖然極性鞭毛菌趨化信號傳導(dǎo)通路與E. coli大體相似，但更為復(fù)雜，比如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）控制MCPs的基因簇數(shù)量較E. coli多，且其細胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)節(jié)蛋白也更多樣［9］。簡單來說，細菌趨化游動主要包括三步：1）MCP精確感受化學(xué)刺激并實現(xiàn)信號放大［18］；2）細胞質(zhì)內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白接收化學(xué)信號并通過CheY傳遞給鞭毛馬達；3）鞭毛馬達感受趨化信號并調(diào)整鞭毛旋轉(zhuǎn)方向，最終產(chǎn)生具有偏向性的趨化游動［19］。需要說明的是，細菌鞭毛馬達旋轉(zhuǎn)由離子（周生鞭毛菌為H+，極性鞭毛菌為Na+）穿過細胞質(zhì)膜沿著電化學(xué)梯度推動。H+或Na+沿著電化學(xué)梯度通過固定在細胞壁上的特定motAB蛋白復(fù)合物，motAB蛋白復(fù)合物沿著鞭毛馬達前進并使其旋轉(zhuǎn)［20］。

1.2 種群水平上的涌動

當(dāng)細菌位于含水粗糙表面時，細胞經(jīng)歷分裂增殖并依靠鞭毛旋轉(zhuǎn)進行種群涌動，其速度（2～10 μm·s-1）遠低于游動?？茖W(xué)工作者在研究細菌涌動機制時發(fā)現(xiàn)：1）涌動依賴于鞭毛旋轉(zhuǎn)，并且鞭毛表達更充分的菌株往往表現(xiàn)出更強的涌動能力；2）涌動需要表面活性劑參與，而合成表面活性劑通常受細菌種群感知（quorum sensing, QS）機制的調(diào)節(jié)［9］。目前，關(guān)于細菌涌動的具體機制及其生物學(xué)意義尚未明確，比如細菌TfP在細菌涌動過程中的作用機制就較為模糊。Shrout等［23］研究P.aeruginosa的野生型菌株及其缺失pilA基因（編碼TfP蛋白）菌株的涌動行為時發(fā)現(xiàn)，pilA基因的缺失顯著促進了細菌涌動；但Murray和Kazmierczak［24］卻發(fā)現(xiàn)pilA基因缺失對細菌涌動影響不大。隨后，Anyan等［25］利用數(shù)學(xué)模擬與實驗相結(jié)合的方法，從物理學(xué)角度進一步檢驗TfP在細菌涌動過程中的作用時發(fā)現(xiàn)，細菌種群涌動時TfP會通過調(diào)控細胞間排列（cell-cell arrangement）而限制其單細胞運動和種群運動。

圖2 E. coli趨化信號傳導(dǎo)通路Fig. 2 Chemotactic signal contransduction path of E. coli［21-22］

當(dāng)前的研究結(jié)果表明，細菌涌動和游動的趨化通路控制基因可能存在顯著差異［26-27］，但由于細菌涌動不僅涉及細胞分裂增殖，還往往受尚未明確的QS機制的影響，因此，人們對細菌涌動的趨化信號傳導(dǎo)通路仍然知之甚少。

1.3 種群水平上的蹭行

細菌通過將TfP發(fā)射出去—與表面結(jié)合—再收縮的方式牽引細菌在固體界面上蹭行，該過程依賴TfP的伸縮而不受制于鞭毛的旋轉(zhuǎn)［24-25］。由于執(zhí)行運動的功能性附屬物不同，細菌蹭行速度（不大于0.1 μm·s-1）遠低于游動和涌動。但是，蹭行對細菌生命過程具有多重意義：1）無法蹭行的細菌不能形成成熟的三維結(jié)構(gòu)生物膜；2）蹭行很可能啟動了其從飽和液態(tài)到固體界面態(tài)轉(zhuǎn)變的信號通路［28］（當(dāng)細菌處在較硬固體界面間時，鞭毛作用大大減弱，蹭行接管細菌遷移的任務(wù)）。

對于E.coli，其TfP介導(dǎo)的趨化蹭行與鞭毛介導(dǎo)的趨化游動通路大體相近，首先MCP感受細胞外趨化物梯度，然后細胞質(zhì)內(nèi)系列調(diào)節(jié)蛋白（ChpA, ChpB, PilK, ChpC, PilH, PilG, PilG-P和PilH-P）接收化學(xué)信號并通過PilG-P和PilH-P傳遞給TfP，TfP接收信號并通過拉伸或收縮進行趨化蹭行［9］。雖然人們了解了E. coli的趨化蹭行傳導(dǎo)通路，但此通路是否能代表所有細菌，有待一一證實。

土壤環(huán)境復(fù)雜多變，可能存在多種趨化機制。Laganenka等［29］發(fā)現(xiàn)E. coli分泌的胞外信使分子（autoinducer）能協(xié)調(diào)細胞與細胞間的通訊交流，進而增強細菌種群的趨化性遷移［30］，這可能是目前尚不清楚的另一種趨化信號傳導(dǎo)機制。土壤中細菌數(shù)量多、組成復(fù)雜（1 g土中細菌數(shù)量約1010個［31］），深入探究細菌適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的多樣化生存策略，將有助于揭示土壤微生物多樣性的內(nèi)在機制，并對微生物學(xué)研究及其相關(guān)交叉科學(xué)研究工作的深入開展具有重要意義。

2 定量細菌趨化性的數(shù)學(xué)模型

定量模型與實驗結(jié)果相互檢驗共同促進了人們對細菌趨化性的理解。數(shù)學(xué)模型可以精確描述細菌特性，例如伊辛模型（Duke和Bray）、Monnod-Wyman-Changeux（MWC）模型［32-33］和受體變量動力學(xué)性質(zhì)模型可分別用于模擬細菌受體簇信號放大和精確適應(yīng)特性。利用此類模型，不僅可以通過數(shù)值模擬仿真單細胞趨化運動，還可以從種群水平上模擬細菌的趨化性。Bray等［18］開啟了用數(shù)值模擬的方法描述單個細菌趨化性的先河，發(fā)現(xiàn)了細菌（E. coli）對很大范圍內(nèi)的引誘劑（5 nmol·L-1～1 mmol·L-1天冬氨酸）具有趨化運動。Emonet等［34］提出了仿真單細胞趨化行為的模擬器AgentCell，Bary等［35］隨后提出了類似的模擬器E.solo。細菌種群水平趨化性的模擬始于Keller-Segel（KS）模型。該模型是1971年Keller和Segel［36］提出的基于擴散和定向運動描述細菌種群趨化行為的一維數(shù)學(xué)模型：

式中，b為細菌種群密度（bacterial population density），ind·mL-1，s為引誘劑濃度（attractant concentration），mol·L-1，μ為細菌隨機運動系數(shù)（bacterial random motility coefficient），mm2·s-1，xo為細菌趨化感應(yīng)系數(shù)（bacterial chemotactic sensitivity coefficient），mm/receptor，D為引誘劑擴散系數(shù)（attractant diffusion coefficient），mm2·s-1，f(b，s)描述引誘劑的消耗或降解。KS經(jīng)典模型能很好地描述細菌在緩慢變化環(huán)境中的趨化行為，一直被沿用至今。但也有不足之處，如不能解釋細菌在快速變化環(huán)境中的趨化行為。Si等［37］在研究時空變化環(huán)境下細菌趨化行為時發(fā)現(xiàn)，在高頻引誘劑濃度變化下，細菌種群響應(yīng)滯后于濃度變化，甚至出現(xiàn)細菌在低濃度區(qū)域聚集的反?，F(xiàn)象。

1975年Lovely和Dahlquist［38］首次將細菌個體細胞觀察結(jié)果與隨機運動系數(shù)(μ)聯(lián)系起來，提供了描述細菌種群運動的宏觀運輸參數(shù)。

式中，v為單個細菌平均游動速度（themeanindividual-cell swimming speed），μm·s-1，t表示單個細菌平均游動時間（the mean individual-cell run time），單位s，θ表示單個細菌平均旋轉(zhuǎn)角度（the mean individual-cell turn angle），單位o。

在種群規(guī)模（population scale）上，細菌趨化運動可用類似于對流運輸系數(shù)描述［36,39］。

式中，vc表示細菌趨化運動速度（bacterial chemotactic speed），μm·s-1。Kd是受體解離平衡常數(shù)（receptor dissociation equilibrium constant），mol·L-1。

在上述研究基礎(chǔ)上，Zaval’skiǐ［40］建立了細菌趨化性動力學(xué)模型：

式中，γo（Hz）為細菌在化學(xué)均勻的介質(zhì)中細胞運動方向改變的頻率，ψ為趨化作用函數(shù)，用式（6）表示。

式中，δ為經(jīng)驗系數(shù)，假如趨化因子能夠被細菌代謝，式（6）應(yīng)該用描述趨化因子消耗或降解的式（7）代替。

式中，K(C)為細菌消耗引誘劑速率，mol·s-1。

式（5）描述細菌在線性化學(xué)梯度下的運動行為，其中（Ⅰ）項是對細菌濃度隨時間的動態(tài)變化的描述；（Ⅱ）項表示細菌在均勻化學(xué)介質(zhì)中的隨機運動；（Ⅲ）項表示細菌向較高濃度引誘劑的遷移行為，取決于引誘劑分子的梯度和細菌受體與引誘劑分子的密切程度。

Lewus和Ford［41］于2001年將數(shù)學(xué)模型與實驗數(shù)據(jù)相結(jié)合，分別基于細菌種群水平和單細胞水平實現(xiàn)了對細菌的隨機運動系數(shù)和趨化運動系數(shù)的定量化，并且提出了無化學(xué)梯度下細菌的隨機運動守恒方程（式（8））和化學(xué)梯度下細菌的偏向性趨化運動守恒方程（式（9）），

式中，μ由式(3)計算得到，v由式(4)計算得到。

結(jié)合實驗數(shù)據(jù)得到細菌個體水平參數(shù)，將其應(yīng)用到細菌種群水平的宏觀運動中可描述細菌種群趨化運動。Joanna等［42］將一維數(shù)學(xué)模型進行優(yōu)化，實現(xiàn)了細菌趨化運動的二維、三維模擬，建議今后的模型使用者根據(jù)實際實驗條件將模型進行修正優(yōu)化，使數(shù)學(xué)模擬結(jié)果盡可能接近實驗真實情況。

3 土壤中影響細菌趨化性的因素

土壤中存在大量孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙大小和孔隙內(nèi)物理、化學(xué)及生物環(huán)境共同作用影響微生物生命歷程以及其群落結(jié)構(gòu)［3,43-44］。細菌常常利用自身趨化性尋找土壤中的營養(yǎng)源（如植物根系分泌或滲出物、其他微生物的胞外分泌物、土壤中的有機物質(zhì)和化肥等），或遠離其中的有害化學(xué)物質(zhì)（如化學(xué)農(nóng)藥、抗生素和有害重金屬離子等）。

3.1 物理因素

土壤的時空異質(zhì)性決定了細菌趨化現(xiàn)象普遍存在，但由于土壤孔隙大小不一、形狀各異，并且其孔隙內(nèi)微環(huán)境條件隨時間和空間動態(tài)變化，因此，細菌在土壤中的運動并不像在自由水體環(huán)境中那么簡單。當(dāng)孔隙尺寸小于細菌鞭毛長度時，即使存在引誘劑或抑制劑，細菌也很難實現(xiàn)趨化運動（由于細菌鞭毛無法旋轉(zhuǎn)不能改變運動方向）［45］。此外，當(dāng)細菌個體尺寸大于孔隙大小時，往往容易阻塞（straining）孔隙、因而阻礙其進行趨化運動［46］。除阻塞外，細菌在土壤多孔介面的吸附是妨礙細菌進行趨化運動的另一個重要原因，其中，細菌和土壤多孔界面之間的Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek（DLVO）相互作用力［47-48］是關(guān)鍵影響因子之一。DLVO理論指出，細菌或膠體和土壤多孔界面之間的相互作用力主要包括三種力，即范德華吸引力、雙電層力和短距離排斥力（包括水合力和空間排斥力等）［49-50］。當(dāng)細菌和土壤多孔介面的電荷符號相同時，雙電層力為排斥力，此時，存在排斥勢壘會阻礙細菌吸附在土壤多孔介面。如果細菌和土壤多孔介面的電荷符號相反時，雙電層力為吸引力，此時，總的相互作用力在任何相互作用距離均為吸引力，因此細菌極易被吸附在土壤多孔介面。

水分條件亦是影響土壤中細菌趨化運動的另一關(guān)鍵因素。水分條件影響并調(diào)節(jié)細菌趨化運動的模式：當(dāng)土壤水分飽和時，土壤孔隙間水膜連續(xù)，細菌可在適宜大小的孔隙內(nèi)趨化游動；當(dāng)土壤水分不飽和時，部分孔隙間水膜不連續(xù)，細菌在粗糙表面上進行趨化涌動；而當(dāng)土壤相對干旱時，蹭行很可能是細菌趨化運動的主要方式；同時，由于土壤孔隙結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部環(huán)境在亞毫米尺度就差異很大，細菌很可能會根據(jù)周圍微環(huán)境變化靈活更換趨化運動模式［9,43-44］，但細菌是如何感知周圍水分變化并靈活調(diào)節(jié)運動附屬物來執(zhí)行適宜的趨化運動呢？詳細機制還有待進一步探究。

此外，細菌的趨化性還受土壤溫度的顯著影響。Adler［51］使用毛細管法研究不同溫度（0～40℃）條件下E. coli趨化性時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度低于15℃時，E. coli不再具有趨化性；而溫度從20℃上升至30℃時，聚集在毛細管附近的細菌數(shù)量則增加了20倍。這是關(guān)于溫度影響細菌趨化性的首次報道，那么溫度影響細菌趨化運動的機制是什么呢？Larsen等［52］發(fā)現(xiàn)，隨著環(huán)境溫度的降低（從25℃降低至5℃），細菌（Vibrio anguillarum）運動速度明顯減小，其對引誘劑的趨化響應(yīng)也變得遲鈍。當(dāng)時，Larsen等［52］猜測，溫度通過影響參與細菌趨化信號傳導(dǎo)的跨膜受體和酶活性，以及其甲基化水平，而改變細菌趨化信號的傳導(dǎo)速度。隨后，Oleksiuk等［53］驗證了上述猜想，并且量化了細菌運動速度與溫度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細菌的趨化運動速度在5～40℃范圍內(nèi)與環(huán)境溫度線性正相關(guān)。

3.2 化學(xué)因素

適宜的pH是細菌生長和執(zhí)行趨化運動的必要條件之一，主要原因是引誘劑具有特定的pH適宜范圍，大部分引誘劑適宜pH范圍為6～9.5，pH小于6或大于9.5時細菌趨化運動能力下降，而當(dāng)pH小于或等于4時其趨化能力基本喪失［54］。此外，離子濃度也顯著影響細菌趨化能力，Larsen等［52］研發(fā)現(xiàn)細菌（V. anguillarum）在低鹽溶液中的趨化性響應(yīng)更為靈敏。此外，細菌趨化運動也受土壤中溶解氧濃度的調(diào)控［9］。例如，Shioi等［55］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶解氧濃度較高時，Salmonella typhimurimu、E. coli和Bacillus subtilis進行遠離高濃度溶解氧的負趨化運動，而當(dāng)溶解氧濃度低于0.25 mmol·L-1時，則進行趨向高濃度溶解氧的正趨化運動。同時，Tao［56］利用KS數(shù)學(xué)模型對細菌趨化運動中的耗氧量進行了計算。但是，人們對氧氣濃度影響細菌趨化性的具體機制尚不明確。此外，土壤溶液重金屬離子和污染物濃度也是影響細菌趨化運動的重要化學(xué)因素［54］。

細菌趨化性是土壤中物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵，受土壤理化性質(zhì)的顯著影響。因此，通過調(diào)節(jié)土壤理化條件（土壤孔隙度、水分、溫度、pH、鹽堿度、氧氣濃度等）來調(diào)控細菌趨化運動，最終實現(xiàn)土壤養(yǎng)分的高效利用是一項長遠而具有深刻意義的重要研究課題。

4 土壤中細菌趨化現(xiàn)象及其意義

4.1 趨化性影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)

環(huán)境中的細菌一般會對多種化學(xué)物質(zhì)具有趨化性，細菌種類不同，引誘劑也存在差別。土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)容易受細菌趨化作用的調(diào)節(jié)，其在土壤根際微環(huán)境中尤為顯著［57］。20世紀(jì)80年代，Caetano-Anollés等［58］發(fā)現(xiàn)了細菌運動性和趨化性在根系定殖過程中的重要作用，表明細菌運動性和趨化性是細菌與植物根表面建立初始“化學(xué)-物理接觸”的重要因素。De Weert等［59］也發(fā)現(xiàn)了趨化性在細菌競爭定殖（competitive colonization）中的必要作用。隨后，Juárez-Hernández等［60］對比了野生型Pseudomonas putidaKT 2440及其趨化受體缺失的突變體在番茄根系的定殖能力，發(fā)現(xiàn)趨化功能健全的野生型菌株更容易定殖到根系表面。綜上可知，細菌趨化性是細菌在作物根系成功定殖的關(guān)鍵。細菌之所以能借助自身趨化性成功定殖于作物根系，主要是因為植物根系分泌的化學(xué)物質(zhì)被微生物視作一種趨化信號（引誘劑-正趨化運動信號或驅(qū)避劑-負趨化運動信號）［61］，它可以影響并調(diào)節(jié)細菌在根系的定殖水平和其在根際土壤中生存的能力，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［62］。此外，Wu等［63］研究連作障礙產(chǎn)生的原因時發(fā)現(xiàn)，連作會導(dǎo)致根系有益微生物數(shù)量減少，而增加致病菌趨化蛋白CheA的表達，具體機制是，連作累計時間效應(yīng)增加了土壤中致病真菌的營養(yǎng)引誘劑（有機酸），顯著促進了致病真菌的生長，致使根系土壤微生物群落發(fā)生了改變。因此，進一步研究細菌趨化性在連作障礙中的作用機制將有助于明確單作系統(tǒng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演變規(guī)律。

今后可從基因水平上研究趨化基因表達（通過改變土壤理化條件）與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)間的內(nèi)在定量關(guān)系。此外，目前關(guān)于細菌趨化性對土壤微生物多樣性影響的相關(guān)研究還不夠深入，人們較多關(guān)注單一菌株的趨化作用。然而，自然環(huán)境中的細菌通常不是單獨生活，而是與其他種群存在競爭、互利共生或交叉喂養(yǎng)等綜合作用。研究多種菌株趨化作用過程中的互作或協(xié)同作用，有助于揭示土壤微生物多樣性內(nèi)在機制。

4.2 細菌趨化性對土壤養(yǎng)分循環(huán)的影響

前人研究表明，細菌趨化性促進海洋生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與循環(huán)［2,64］。單從物理作用的角度分析，細菌鞭毛運動能夠使其周圍液體產(chǎn)生流場（flow field）［65］，該流場會影響化學(xué)物質(zhì)的運輸、細胞與其臨近界面間的物理作用以及細胞間的耦合運動［66］；而事實上這一過程往往是更為復(fù)雜的生物-物理-化學(xué)綜合作用。Smriga等［2］發(fā)現(xiàn)，死亡浮游植物細胞裂解后釋放大量溶解性有機物，而這些養(yǎng)分物質(zhì)則會吸引具有趨化能力的細菌，該趨化過程僅僅持續(xù)約5～10 min，期間，細菌將裂解細胞捕食完后逐漸趨于隨機運動，直至下一個捕食目標(biāo)的出現(xiàn)。Pedler等［64］進一步說明了細菌趨化性具有促進海洋中碳循環(huán)的功能。

與海洋生態(tài)系統(tǒng)相比，土壤生態(tài)環(huán)境中養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與循環(huán)更為復(fù)雜，其中，微生物的活動顯得至關(guān)重要。在這一過程中，微生物通過釋放胞外活性酶，分解大部分有機質(zhì)或促進養(yǎng)分物質(zhì)的礦化，以便從復(fù)雜的有機化合物中獲取營養(yǎng)［31］。土壤中死亡的微生物、動物和植物枯枝落葉以及部分有機膠體顆粒均是細菌的營養(yǎng)源，細菌能將其礦化、固持，將植物不可直接利用的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為微生物量碳、氮等。該過程加速了土壤中養(yǎng)分循環(huán)和能量流動，促進作物對養(yǎng)分的吸收利用。目前，我們關(guān)于細菌趨化性如何促進土壤養(yǎng)分循環(huán)的研究還處于定性化初級研究階段。

4.3 細菌趨化性促進土壤有機污染物降解

微生物在自然環(huán)境中進化出了完善的趨化作用機制來應(yīng)對生存環(huán)境變化，例如，細胞通過MCP感知周圍化學(xué)信號的變化，借助鞭毛和TfP執(zhí)行偏向性運動，以便尋找適宜的生存環(huán)境［20］。近幾十年來，科研工作者在細菌對環(huán)境污染物趨化性方面開展了大量卓有成效的研究［3,67］，并分離和鑒定了多種對環(huán)境異源污染物具有趨化性的微生物（表1）。越來越多的證據(jù)顯示，具有運動能力的微生物對其可降解的環(huán)境污染物幾乎均具有趨化性，且大多細菌擁有明確探測和響應(yīng)化學(xué)污染物的感官系統(tǒng)［68］。細菌對特定污染物的趨化基因與降解基因間有著密切聯(lián)系，這點已從細菌對其大多降解底物具有趨化性的表觀現(xiàn)象中得到初步證實［69］。Harwood等［70］也從分子生物學(xué)水平找到了直接證據(jù)，發(fā)現(xiàn)Pseudomonas putidaPRS2000的4-基苯甲酸降解基因與趨化基因是被質(zhì)粒共同調(diào)節(jié)的。隨后，Hawkins和Harwood［71］發(fā)現(xiàn)Ralstonia eutrophaJMP134的質(zhì)粒上同時具有2, 4-二氯苯氧乙酸的趨化基因和降解基因。

細菌通過對可代謝污染物的趨化作用可促進其對污染物的降解，該過程是生物修復(fù)受污染土壤的重要內(nèi)容。Adadevoh等［3,67］結(jié)合土柱實驗和數(shù)學(xué)模型，在研究萘降解菌Pseudomonas putidaG7和其趨化性突變體Pseudomonas putidaG7 Y1對萘的趨化和降解作用時發(fā)現(xiàn)，細菌趨化能力延長了其在萘分布均勻的土柱中的穿透時間，進而提高了對萘的降解效率（萘的回收率降低了45%）。實際上，細菌對污染物的趨化運動實現(xiàn)了降解菌株與目標(biāo)污染物之間的直接接觸，而這樣的接觸是實現(xiàn)生物修復(fù)的關(guān)鍵。同時，趨化性增加降解菌尋找合適碳源、氮源和其他養(yǎng)分或能源的機會，使降解菌在與土著微生物的營養(yǎng)競爭過程中不至于一敗涂地（甚至表現(xiàn)出優(yōu)勢），這對于低濃度污染物的生物修復(fù)尤為重要［68-69］?？傊?，土壤細菌趨化性研究將為土壤污染的生態(tài)防治和生物修復(fù)等應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。然而，利用土壤細菌趨化性實現(xiàn)對土壤污染的原位修復(fù)還有很長的一段路要走。

表1 對土壤異源污染物具有正趨化作用的微生物一覽表Table 1 A list of microbes showing positive chemotaxis to soil heterologous pollutants

續(xù)表

5 土壤細菌趨化性的研究方法

作為天然的多孔介質(zhì)，土壤由復(fù)雜的物理拓撲結(jié)構(gòu)和孔隙網(wǎng)絡(luò)內(nèi)各種各樣的化學(xué)物質(zhì)、養(yǎng)分或電子受體等各類動態(tài)梯度組成，土壤中孔隙結(jié)構(gòu)不僅數(shù)量眾多而且時空差異性大。這些特征在亞毫米尺度上就差異很大，使得土壤細菌趨化性的宏觀研究結(jié)果難以解釋，同時，土壤的不透明性和復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)使得土壤微生物過程的原位觀測變得尤為困難，一定程度上限制了土壤細菌趨化性的研究［111］。為實現(xiàn)細菌趨化運動的定性或定量化研究，學(xué)者們研發(fā)了系列細菌趨化性研究方法，如毛細管法（圖3A）、瓊脂平板法（圖3B）和砂柱實驗系統(tǒng)（圖3C）及熒光原位雜交微流體顯微術(shù)（圖3D）。下面簡要概述前三種方法并重點介紹熒光原位雜交微流體顯微術(shù)及其在土壤細菌趨化性研究中的應(yīng)用。

5.1 毛細管法（capillary assay）

1884年，Pfeffer［4］將裝有天冬氨酸溶液的毛細管水平放置到細菌懸浮液中，發(fā)現(xiàn)細菌會跟蹤擴散出來的天冬氨酸分子，聚集在毛細管管口并進入毛細管內(nèi)，由此發(fā)現(xiàn)了細菌的趨化現(xiàn)象。Sherris等［112］使用相似的扁平毛細管（flat capillary tube）觀察了細菌對空氣或精氨酸趨化游動的現(xiàn)象。毛細管法是細菌趨化性研究最原始的方法，該方法雖然能實現(xiàn)細菌趨化游動的半定量化［1］，但不能用于研究細菌的趨化涌動和趨化蹭行。

5.2 瓊脂平板法（agar-plate assay）

瓊脂平板法常用于研究細菌對可代謝引誘劑的趨化運動。如將菌液接種到瓊脂培養(yǎng)基中心，趨化細菌消耗中心處營養(yǎng)物后會向外散開尋找新營養(yǎng)源；又或是將引誘劑置于瓊脂培養(yǎng)基中心，一定時間形成濃度梯度后于特定位置接種菌液，記錄細菌在引誘劑梯度上的趨化運動［1,9］。該方法的優(yōu)勢在于調(diào)節(jié)瓊脂培養(yǎng)基中瓊脂濃度（w/v）可實現(xiàn)細菌運動模式的研究。普遍認為當(dāng)瓊脂濃度小于0.3%時，細菌在液體環(huán)境中游動；當(dāng)瓊脂濃度介于0.3%與1.0%之間時，細菌進行種群涌動；而瓊脂濃度大于1.0%時，大量細菌在固體界面間蹭行［9,25,27-28］。人們常通過對比細菌在不同化學(xué)梯度瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形貌來分析細菌是否對該物質(zhì)具有趨化作用，而事實上，菌落擴增不能單單歸因于細菌的趨化運動，細菌分裂增殖引起的細胞排擠也很可能促使細胞向外沿移動，因此需結(jié)合細菌生長動力學(xué)模型、計算養(yǎng)分擴散與消耗速率等，綜合分析后再做判定［44］。此外，該方法的優(yōu)點在于簡便、經(jīng)濟，但缺點是難以精確控制細菌運動環(huán)境條件（水、養(yǎng)分、氧氣等）［9］。

5.3 砂柱實驗系統(tǒng)（sand-column experimental

system）

砂柱實驗系統(tǒng)常用于模擬細菌在多孔異質(zhì)介質(zhì)（土壤）中與水和溶質(zhì)共同遷移的特征，借助化學(xué)物質(zhì)濃度梯度再現(xiàn)土壤異質(zhì)特性，調(diào)控石英砂粒徑分布生成一定范圍內(nèi)的孔隙分布的砂土介質(zhì)［42］。該系統(tǒng)操作便捷，價格便宜，贏得了眾多研究者的青睞，不足之處在于1）無法實現(xiàn)細菌在含有養(yǎng)分梯度砂柱中趨化過程的可視化；2）不適于細質(zhì)地土壤的模擬；3）恒定控制砂柱內(nèi)非飽和水環(huán)境十分困難［67］。

5.4 熒光原位雜交微流體顯微術(shù)（Fluorescence in situ hybridization microfluidic microscopy, FISHMM）

熒光原位雜交技術(shù)、微流控技術(shù)和近代光學(xué)顯微術(shù)相結(jié)合的集合技術(shù)簡稱為FISHMM，該集合不僅具有非接觸、無損傷的特點，還快速、便捷，實現(xiàn)了細菌在可控微環(huán)境中趨化運動的可視化、定量化和數(shù)據(jù)化。DNA熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法。該項技術(shù)安全、快速、準(zhǔn)確、原位以及可動態(tài)觀察等特點使其成為環(huán)境微生物學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)和微生物診斷學(xué)研究的可靠工具［113］。但傳統(tǒng)的熒光蛋白分子探針（綠色熒光蛋-GFP、紅色熒光蛋白-RFP、黃色熒光蛋白-YFP等）標(biāo)記細菌，存在長時間跟蹤細胞軌跡激發(fā)光激發(fā)條件下熒光易淬滅的缺點。新型的納米生物探針量子點具有光化學(xué)穩(wěn)定性高、抗光漂白能力強、熒光不易淬滅等優(yōu)良光學(xué)特性，能對完整的活細胞進行定性、定量和定位的測量，功能強大，可操作性強［114］，預(yù)計新一代量子點技術(shù)將在土壤細菌趨化性及高清晰度活細胞成像、長時程觀察活細胞遷移等方面發(fā)揮巨大潛力。

相比較傳統(tǒng)的細菌趨化性研究方法，微流體技術(shù)能更精確地控制細菌趨化運動的微環(huán)境，開啟了從單細胞尺度原位探究細菌趨化性的大門。微流控技術(shù)能夠在微米尺度上定量分析細菌的趨化運動過程。Mao等［115］首次將微流技術(shù)應(yīng)用到細菌趨化性研究中來，模擬構(gòu)建了微生物棲息地的微觀結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了細菌趨化過程中細胞運動軌跡的可視化。為模擬土壤中微孔結(jié)構(gòu)，越來越多的科學(xué)工作者專注于微流體設(shè)備平臺的搭建，不僅能制出比線性結(jié)構(gòu)外更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微流體，還能控制微流體表面的濕度、粗糙度和親疏水性等（分辨率可達到2 μm）［5-6］。總之，微流控技術(shù)具有能夠精確控制微通道反應(yīng)器中流體速度、水分含量、溫度大小和化學(xué)梯度及表面特性等物理化學(xué)生物環(huán)境的能力。

簡言之，首先利用微流體技術(shù)在透明且生物相容的有機材料（如：聚二甲基硅氧烷—PDMS或聚乙二醇—PEGDA等水凝膠）上拓印出幾微米至數(shù)百微米的微溝道，用以模擬土壤中大小不一、形狀各異的孔隙結(jié)構(gòu)，再結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)和光學(xué)顯微技術(shù)3D追蹤細胞的運動軌跡，二者結(jié)合實現(xiàn)了基于多細胞和微孔尺度上土壤細菌趨化作用機制的研究。熒光顯微鏡研究的快速發(fā)展，自動成像和細菌追蹤技術(shù)的進步，為細胞內(nèi)部形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命運動現(xiàn)象觀測提供技術(shù)支撐。值得一提的是，細菌運動軌跡的3D追蹤一直是細菌趨化運動研究的核心技術(shù)。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡捕捉到的照片只是細菌空間運動軌跡的2D投影。不過，3D軌跡跟蹤顯微鏡能夠得到單個細菌的時空運動信息，其工作原理是基于通過3D顯微鏡的電動載物臺的自動運動確保單個細菌的自動聚焦，該類顯微鏡為我們提供了周生鞭毛菌E. coli和單鞭毛菌Caulobacter crescentus單個細胞運動的基礎(chǔ)信息［13］，此技術(shù)的缺點在于一次只能追蹤一個細菌。近階段，數(shù)字全息顯微術(shù)（digital holographic microscopy）和離焦顯微術(shù)（defocused microscopy）［116］能夠在不移動顯微鏡載物臺的情況下，同時捕獲上百個微生物的位置，二者功能強大，應(yīng)用前景廣闊。

總之，由現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物物理學(xué)研究手段結(jié)合的熒光原位雜交微流體顯微術(shù)，實現(xiàn)了從土壤孔隙水平和細胞尺度上探究土壤中微生物運動，能夠可視化土壤內(nèi)部生物過程，為定量生物學(xué)研究提供了強有力的工具，外加操作簡便、節(jié)約空間，未來必將受到各個研究實驗室的青睞。

圖3 細菌趨化性研究方法：改進的毛細管法（A）；瓊脂平板法（B）；砂柱實驗系統(tǒng)（C）；熒光原位雜交微流體顯微術(shù)（D）Fig. 3 Bacterialchemotaxis assays: Modified capillary assay (A); Agar-plate method (B); Sand-column experimental system (C); and Fluorescence in situ hybridization microfluidic microscopy (D)

6 研究展望

雖然土壤細菌趨化性研究取得了一定的進展，但還有很多工作值得科學(xué)研究人員的重視并深入探究，例如：1）土壤孔隙和細胞水平上探究細菌對土壤動植物分泌物、土壤異源污染物的趨化機理，剖析細菌趨化基因與降解和代謝基因間的分子生物學(xué)關(guān)系；2）探究QS影響細菌種群的趨化性遷移的機制，進一步解析細菌趨化過程中細胞間的信號傳遞機制；3）探究細菌趨化性在細菌生存調(diào)控、種間關(guān)系調(diào)節(jié)和土壤微生物多樣性維持及土壤養(yǎng)分再分配中的作用機制；4）探究細菌TfP介導(dǎo)細菌趨化運動的機制，并分析探討其與鞭毛介導(dǎo)趨化運動的協(xié)作機制；5）研究細菌趨化性與土壤物理化學(xué)因素（土壤含水量、質(zhì)地、孔隙結(jié)構(gòu)、礦物組分等）的相互作用。這些問題均有待更多的科研工作去揭示?？傊?，對土壤細菌趨化性的深入研究有助于揭示細菌對環(huán)境的適應(yīng)機制，在土壤微生物多樣性維持、土壤養(yǎng)分分配和土壤污染生態(tài)防治及微生物過程修復(fù)等應(yīng)用研究中意義重大，值得進行更多的深入研究。

致 謝 感謝博士生王燕和韓天富對文獻收集和討論方面提供幫助。