人ⅡA型磷脂酶A2 N端15肽及其衍生肽的殺菌活性▲

郭 娟 李永杰 梁寧生

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，南寧市 530021，電子郵箱：1599168279@qq.com)

細(xì)菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，不僅危害人類健康，還給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在歐盟國(guó)家，每年因耐藥菌感染引起的死亡數(shù)超過25 000人，費(fèi)用總計(jì)超過9億歐元；在美國(guó)，每年因耐藥菌感染引起的死亡數(shù)約有23 000人，醫(yī)療費(fèi)用達(dá)260億美元[1]。開發(fā)新型抗菌藥物以有效對(duì)抗耐藥菌是解決耐藥菌感染的方法之一?？咕淖畛跏窃谏矬w內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類具有抗菌活性的小分子多肽，后來(lái)出現(xiàn)人工合成的抗菌肽，它們具有分子量小、抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性、作用機(jī)理獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)[2]，有望成為新型高效抗菌藥物，從而解決耐藥菌問題。目前，有幾種人工合成的抗菌肽已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，用于局部和全身感染的治療。Pexiganan是一種含有22個(gè)氨基酸的magainin-2類似物，是第一種用于糖尿病足潰瘍局部治療的抗菌肽[3]。

人ⅡA型磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)，也稱為血小板型PLA2，是哺乳動(dòng)物重要的抗菌蛋白之一，在宿主防御細(xì)菌感染方面發(fā)揮重要的作用[4]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)ⅡA 型PLA2對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有殺菌作用[5]，并且根據(jù)其C-末端及N-末端分別衍生合成的多肽也都具有殺菌活性[6-7]。本研究根據(jù)ⅡA型PLA2的N末端15個(gè)氨基酸序列合成多肽，并以此多肽為模板，改變不同位置的氨基酸，最終合成6種衍生肽；比較模板肽ⅡA型PLA2N端15肽(PLA2-N15)及6種衍生肽的殺菌活性，進(jìn)而分析多肽分子結(jié)構(gòu)與殺菌活性間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株：革蘭陰性菌大腸埃希菌ATCC 44113以及革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌ATCC 26003均由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑：模板肽PLA2-N15(批號(hào):pep16080425)及其6種衍生肽PLA2-H6R(批號(hào):pep16080426)、PLA2-H6R-T12R(批號(hào):pep16080429)、PLA2-H6R-T12V(批號(hào):pep16040509)、PLA2-N4R-H6R(批號(hào):pep16080428)、PLA2-N4R-H6R-T13R(批號(hào):pep16080430)、PLA2-N1A-H6R-T12L(批號(hào):pep16080427)均由本課題組設(shè)計(jì)經(jīng)上海波泰有限公司合成，純度均為90%；1%小牛血清白蛋白(V/W)(批號(hào):323N057)由北京索萊寶科技有限公司提供；RPMI-1640(批號(hào):0025316)培養(yǎng)基由Biological Industries公司提供；無(wú)水氯化鈣(批號(hào):10043-52-4)由成都市科隆化工試劑廠提供；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(純度≥99%，批號(hào):513C0412)由北京索萊寶科技有限公司提供；LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào):170206)由北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供；LB培養(yǎng)基粉(批號(hào):A507007-0205)由生工生物工程股份有限公司(上海)提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器： (1)DRP-9272型恒溫培養(yǎng)箱(上海森信儀器有限公司)；(2)AnkeTGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠)；(3)Thermo MAXQ8000型恒溫?fù)u床(Thermo Scientific Electron公司)；(4)UV756型分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；(5)DK-914型恒溫水浴鍋(上海森信儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多肽的設(shè)計(jì)與合成：查詢NCBI網(wǎng)站的基因庫(kù)，獲取人ⅡA型PLA2蛋白質(zhì)N末端第1～15個(gè)氨基酸序列NLVNFHRMIKLTTGK (N為天冬酰胺，L為亮氨酸，V為纈氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，H為組氨酸，R為精氨酸，M為甲硫氨酸，I為異亮氨酸，K為賴氨酸，T為蘇氨酸，G為甘氨酸)。以上述氨基酸序列為模板合成PLA2-N15及其衍生肽。(1)PLA2-H6R，第6位的H替換為R；(2)PLA2-H6R-T12R，第6位的H替換為R、第12位的T替換為R；(3)PLA2-H6R-T12V，第6位的H替換為R、第12位的T替換為V；(4)PLA2-N4R-H6R，第4位的N替換為R、第6位的H替換為R； (5)PLA2-N4R-H6R-T13R，第4位的N替換為R、第6位的H替換為R、第13位的T替換為R；(6)PLA2-N1A-H6R-T12L，首位的N替換為A、第6位的H替換為R、第12位的T替換為L(zhǎng)。見表1。

表1 PLA2-N15及其衍生肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)改變特點(diǎn)

注：下劃線標(biāo)注者代表被替換的氨基酸。

1.2.2 多肽的配制與保存：將PLA2-N15及其6種衍生肽分別溶于400 μl滅菌的雙蒸水中，配制成濃度為10 g/L的多肽母液，以20 μl/管分裝于EP管中，-20℃冷凍保存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取用，避免反復(fù)凍融。

1.2.3 殺菌活性的測(cè)定：采用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法[8]測(cè)定多肽殺菌活性。(1)細(xì)菌培養(yǎng)及菌液制備。取過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，按1 ∶50的比例加入3 ml新鮮的LB培養(yǎng)液中，置于37℃的恒溫?fù)u床孵育2.5 h，達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。室溫下1 000 r/min離心45 s后收集細(xì)菌，用生理鹽水洗滌細(xì)菌并再次離心，棄上清液，將所得細(xì)菌沉淀物重懸于500 μl生理鹽水并混勻，于紫外分光光度計(jì)的540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，記錄吸光度值達(dá)0.1時(shí)所需的細(xì)菌量(μl)，計(jì)算細(xì)菌的稀釋倍數(shù)，并將細(xì)菌稀釋至每毫升1×107菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)備用。(2)配制細(xì)菌孵育體系。取過濾后的RPMI-1640液900 μl，加入50 μl小牛血清白蛋白(1%)、20 μl 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、20 μl氯化鈣(1 mmol/L)，配制成pH≈7.40的反應(yīng)體系。(3)實(shí)驗(yàn)分組。將每條衍生肽分為對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(衍生肽終濃度分別為8、40、200、1 000 μg/ml)，取80 μl反應(yīng)體系，各實(shí)驗(yàn)組加10 μl菌液和10 μl相應(yīng)終濃度的衍生肽，對(duì)照組加入10 μl菌液和等體積的生理鹽水。混勻后置于37℃恒溫水浴2 h。(4)計(jì)算殺菌率。2 h后從上述各反應(yīng)體系中取出反應(yīng)液40 μl，加入360 μl滅菌生理鹽水中，連續(xù)10倍稀釋，共稀釋5次，取100 μl稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿(直徑約55 mm)中，加入滅菌的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂6 ml搖勻，待瓊脂凝固后，放入37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)18～24 h。計(jì)數(shù)瓊脂板上的CFU，取CFU為30～300之間的瓊脂板進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算衍生肽作用后的殺菌率(%)，殺菌率=(對(duì)照組CFU-實(shí)驗(yàn)組CFU)/對(duì)照組CFU×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌率比較 多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時(shí)，6種衍生肽的殺菌率均高于PLA2-N15(均P<0.05)；任一濃度下PLA2-H6R-T12V與PLA2-N1A-H6R-T12L的殺菌率均高于PLA2-N15及其他4種衍生肽(均P<0.05)；多肽濃度為8 μg/ml、40 μg/ml時(shí)，PLA2-H6R-T12V的殺菌率均高于PLA2-N1A-H6R-T12L(均P<0.05)。見表2。

表2 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌率比較(x±s，%)

注：與PLA2-N15比較，aP<0.05；與PLA2-H6R比較，bP<0.05；與PLA2-H6R-T12V比較，cP<0.05；與PLA2-N1A-H6R-T12L比較，dP<0.05。

2.2 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對(duì)革蘭陰性菌的殺菌率比較 多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時(shí)，除PLA2-H6R外，其他5種衍生肽的殺菌率均高于PLA2-N15(均P<0.05)；多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時(shí)，PLA2-H6R-T12V與PLA2-N1A-H6R-T12L的殺菌率均高于其他4種衍生肽(均P<0.05)；多肽濃度為40 μg/ml時(shí)，PLA2-H6R-T12V的殺菌率低于PLA2-N1A-H6R-T12L(P<0.05)。見表3。

表3 不同多肽濃度PLA2-N15及其衍生肽對(duì)革蘭陰性菌的殺菌率比較(x±s,%)

注：與PLA2-N15比較，aP<0.05；與PLA2-H6R比較，bP<0.05；與PLA2-H6R-T12V比較，cP<0.05；與PLA2-N1A-H6R-T12L比較，dP<0.05。

3 討 論

3.1 PLA2-N15及其衍生肽的設(shè)計(jì) 利用美國(guó)NCBI網(wǎng)站的基因庫(kù)，查詢目前能夠獲取的所有哺乳類生物ⅡA型PLA2的N末端15個(gè)氨基酸殘基序列，包括人、猩猩、猴、兔、牛、豚鼠、大鼠、小鼠共8種生物，其氨基酸殘基序列如圖1所示。對(duì)8種生物氨基酸序列的構(gòu)成情況進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同物種第5、8、9、13、14、15位的氨基酸完全一致，其他位置上則存在差別。前期研究表明，多肽分子的酸堿性和疏水性對(duì)其殺菌活性有重要影響[9]，但不同的肽分子其殺菌活性又有所不同。故我們?cè)冖駻型PLA2的N末端15個(gè)氨基酸殘基序列多肽分子中對(duì)不同位置的酸堿性和疏水性氨基酸進(jìn)行改造，并分析其殺菌活性。考慮到高度保守的氨基酸對(duì)分子結(jié)構(gòu)可能起到關(guān)鍵作用，我們?cè)谠O(shè)計(jì)衍生肽時(shí)不改變其高度保守的氨基酸；同時(shí)，不同物種ⅡA型PLA2的N末端氨基酸序列的第2位氨基酸種類雖不同，但性質(zhì)相同，都是疏水性氨基酸，故也不作改變，最終選擇第1、4、6、12、13位氨基酸進(jìn)行改造。

圖1 8種哺乳類生物ⅡA型PLA2N末端15個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成情況

注：上排數(shù)字(1～15)代表多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸順序；下排數(shù)字代表氨基酸取代次數(shù)(與人ⅡA型PLA2N末端15個(gè)氨基酸殘基相同位置比較)。

3.2 PLA2-N15及其衍生肽的分子結(jié)構(gòu)與殺菌活性的關(guān)系

3.2.1 多肽的殺菌作用與疏水性氨基酸的關(guān)系：任一濃度下，PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌率高于其他多肽，在200 μg/ml和1 000 μg/ml下對(duì)革蘭陰性菌的殺菌率高于其他多肽(P<0.05)。提示7種多肽中殺菌作用最強(qiáng)的是多肽PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L。分析其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與PLA2-N15相比，多肽PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L都增加了疏水性氨基酸，疏水性氨基酸比例由0.467分別上升至0.533和0.600，提示適度增加疏水性氨基酸比例可明顯增強(qiáng)殺菌活性。Yin等[10]的研究結(jié)果也顯示，增加抗菌肽疏水性在一定程度上可改善殺菌活性[11]。同時(shí)，當(dāng)多肽濃度小于200 μg/ml時(shí)，PLA2-N1A-H6R-T12L對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌活性低于PLA2-H6R-T12V(P<0.05)，可能與其將首位親水性氨基酸N替換為疏水性氨基酸A有關(guān)，提示首位為親水性氨基酸對(duì)于提高ⅡA型PLA2N端肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌活性更為重要，這點(diǎn)不同于Ⅰ型PLA2[11]。對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的殺菌活性，多肽PLA2-N1A-H6R-T12L均明顯強(qiáng)于PLA2-H6R-T12R，分析結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，前者同時(shí)增加堿性氨基酸和疏水性氨基酸比例，而后者僅增加堿性氨基酸，提示適當(dāng)增加疏水性氨基酸比例能更有效地提高多肽的抗菌活性。與PLA2-N15相比，衍生肽PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的殺菌活性均增強(qiáng)，這可能與它們的疏水性結(jié)構(gòu)更易于與細(xì)菌表面結(jié)合有關(guān)。進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將為今后抗菌肽新藥的開發(fā)與應(yīng)用提供新依據(jù)。

3.2.2 多肽殺菌作用與堿性氨基酸的關(guān)系：多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，抗菌肽是通過損傷細(xì)菌細(xì)胞膜來(lái)發(fā)揮殺菌作用的[12]。而抗菌肽發(fā)揮殺菌作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是堿性氨基酸，可使抗菌肽分子帶正電荷，并與帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜表面相結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡而起到滅菌作用[13]。Malmsten等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，增加抗菌肽分子正電荷數(shù)，其抗菌活性也隨之增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，PLA2-N15及其6種衍生肽在一定濃度下對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有殺菌作用，且多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時(shí)，6種衍生肽的殺菌作用均強(qiáng)于PLA2-N15。其中，與PLA2-N15相比，多肽PLA2-H6R將弱堿性氨基酸(H)替換為強(qiáng)堿性氨基酸(R)，凈正電荷未增加，其殺菌活性弱于PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L；多肽PLA2-N4R-H6R、PLA2-H6R-T12R和PLA2-N4R-H6R-T13R除了將弱堿性氨基酸(H)替換為強(qiáng)堿性氨基酸(R)，還將中性氨基酸(N或T)替換為堿性氨基酸(R)，凈正電荷數(shù)由+4分別增加至+5、+5和+6，多肽濃度為200 μg/ml和1 000 μg/ml時(shí)，其對(duì)革蘭陰性菌的殺菌活性較PLA2-N15、PLA2-H6R均增強(qiáng)，同時(shí)，PLA2-H4R-H6R(1 000 g/ml時(shí))、PLA2-H6R-T12R(200 g/ml時(shí))和PLA2-N4R-H6R-T13R(除8 g/ml外)對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌活性均強(qiáng)于PLA2-H6R，且三種衍生肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的殺菌作用均強(qiáng)于PLA2-N15(除8 g/ml外)，提示增加凈正電荷有助于增強(qiáng)其殺菌活性，這與我們前期的研究結(jié)果類似[15]，但其殺菌效果仍弱于PLA2-H6R-T12V和PLA2-N1A-H6R-T12L，可能與后兩種多肽結(jié)構(gòu)中均包含有4個(gè)堿性氨基酸以及凈正電荷數(shù)只增加到+4有關(guān)。這是因?yàn)槟０?5肽含有4個(gè)正電荷，已經(jīng)屬于堿性較強(qiáng)的分子，進(jìn)一步增加凈正電荷數(shù)，使抗菌肽與細(xì)菌膜結(jié)合牢固，反而影響其穿膜效率，最終導(dǎo)致抗菌肽殺菌活性降低[16]。

綜上所述，人ⅡA型PLA2N端衍生肽的殺菌活性與其疏水性氨基酸比例及位置、氨基酸的酸堿性密切相關(guān)，適當(dāng)?shù)奈恢迷黾邮杷园被峄驂A性氨基酸，在一定程度上可增強(qiáng)衍生肽的殺菌活性，且將衍生肽第12位氨基酸替換為疏水性氨基酸時(shí)殺菌活性最強(qiáng)，這或可為今后開發(fā)新的抗菌藥物提供新思路。