不同程度臟腑虛損哮喘患者血漿左旋精氨酸和不對(duì)稱二甲基精氨酸水平以及肺功能的研究▲

劉慧芳 李風(fēng)森 姜 敏

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，烏魯木齊市 830000，電子郵箱：huihui19830303@163.com)

支氣管哮喘(哮喘)是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與、以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病。流行病學(xué)研究表明，在許多國(guó)家和地區(qū)哮喘的患病率呈上升趨勢(shì)，特別是近二十年來其患病率和病死率均呈增加趨勢(shì)[1]。

細(xì)胞分子和動(dòng)物模型研究結(jié)果均顯示，線粒體功能障礙可導(dǎo)致氧化磷酸化異常，從而增加細(xì)胞活性氧含量從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞受損[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明哮喘模型動(dòng)物的氣道中也存在功能改變的線粒體，提示線粒體參與了氣道上皮損傷與哮喘的發(fā)病機(jī)制，即活性氧過多導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡，從而引起氣道上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激[3-5]。此外，過多的過氧亞硝酸陰離子可以通過降解細(xì)胞色素C的血紅素基團(tuán)從而引起細(xì)胞損傷和線粒體功能障礙[6]。不對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是左旋精氨酸(L-arginin，L-Arg)甲基化后的產(chǎn)物，其作為內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的抑制劑，能與L-Arg競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NOS，使NOS解偶聯(lián)從而生成過氧亞硝酸陰離子[7-8]。而L-Arg與NOS結(jié)合是降低ADMA-NOS解偶聯(lián)的有效途徑。此外，已有研究者提出血漿中L-Arg與ADMA的比值可以作為NOS功能受損的指標(biāo)之一[7，8-10]。基于二者之間的關(guān)系，我們認(rèn)為采用L-Arg/ADMA比值的變化來評(píng)估ADMA或L-Arg在體內(nèi)的變化趨勢(shì)更有意義。

中醫(yī)認(rèn)為，哮病的發(fā)生為宿痰內(nèi)伏于肺，附加外感、飲食、情志、勞倦等因素，以致痰阻氣道、肺氣上逆所致。哮病的病理因素以痰為主，痰的產(chǎn)生責(zé)之于肺不能布散津液、脾虛不能運(yùn)輸精微，腎虛不能蒸化水液，以致津液凝聚化飲成痰，內(nèi)伏于肺，成為發(fā)病的“宿根”，根本因素在于肺脾腎三臟虛損。發(fā)病之初以肺虛為主，病情尚輕，以肺系功能異常為主要表現(xiàn)；遷延日久則可因耗傷肺氣、肺陰而累及脾臟，發(fā)展為肺脾兩虛，病情加重；隨著病情發(fā)展，最終導(dǎo)致肺、脾、腎三臟皆虛，以致水液代謝失常情況愈發(fā)嚴(yán)重，宿痰內(nèi)伏，加之肺虛衛(wèi)外不固，外邪易侵發(fā)病。病位雖在肺，但直關(guān)脾腎，且隨著臟腑虛損情況的加重，病情也隨之加重，存在著肺氣虛、肺脾氣虛、肺脾腎俱虛的證候演變,臟腑虛損狀況反映著病情嚴(yán)重程度。本研究旨在探討不同程度臟腑虛損哮喘患者L-Arg/ADMA比值和肺功能的變化情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年11月至2017年5月在我院門診及住院部確診為哮喘急性發(fā)作期的122例患者作為哮喘組,其中男41例，女81例；年齡17～65(48.34±10.49)歲；肺氣虛者47例，肺脾氣虛者39例，肺脾腎虛者36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合哮喘急性發(fā)作期的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并能接受病情觀察和各項(xiàng)檢查；(2)年齡16～65歲；(3)能夠理解研究目的，并簽署知情同意書，自愿參加研究的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠或哺乳期婦女；(2)合并肺源性心臟病、肺癌、結(jié)核、肺纖維化等其他呼吸系統(tǒng)疾病及呼吸衰竭接受或未接受機(jī)械通氣者；(3)任何部位惡性腫瘤、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；(4)精神病患者或精神異?；颊?。選擇同期在我院進(jìn)行體檢的44例健康正常人作為正常對(duì)照組。其中男15例，女29例；年齡24～64(47.66±10.89)歲，4組研究對(duì)象一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 4組研究對(duì)象一般資料的比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)：支氣管哮喘根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行診斷。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)臟腑虛損評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：參照《臨床中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[12]中“哮病”和《中醫(yī)診斷學(xué)》[13]中“臟腑辨證”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并參照支氣管癥候診斷的相關(guān)文獻(xiàn)[14]制定。(1)肺氣虛：氣短、喘息、咳嗽，動(dòng)則加重；神疲、乏力或自汗；惡風(fēng)；舌質(zhì)淡、苔白，脈沉細(xì)或細(xì)弱或濡緩無力。(2)肺脾氣虛：咳嗽、氣短、喘息，活動(dòng)后加重，痰清??；納呆或食少；胃脘脹滿或食后脹甚或便溏；神疲乏力，少氣懶言，面白惡風(fēng)，自汗易感；舌體胖大或有齒痕，舌苔薄白或膩，脈沉細(xì)或沉緩或細(xì)弱。(3)肺脾腎虛：咳嗽、氣短、喘息，不動(dòng)時(shí)即感喘，呼多吸少；腰膝酸軟，小便頻數(shù)清長(zhǎng)，夜尿或遺尿；納呆或食少；胃脘脹滿或食后脹甚或便溏；惡風(fēng)自汗，畏寒肢冷；舌質(zhì)淡，舌苔白，脈沉細(xì)無力。

1.3 血漿L-Arg及ADMA的檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本采集及處理：采集研究對(duì)象靜脈血5 ml置入乙二胺四乙酸抗凝管，哮喘患者為停用吸入性糖皮質(zhì)激素7～14 d后留取標(biāo)本。將標(biāo)本3 500 r/min離心15 min后取上清液，分裝于EP管中，-80℃保存。

1.3.2 主要試劑和儀器：(1)L-Arg及ADMA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)：140321、140524)，13C6-L-Arg購(gòu)自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室有限公司(批號(hào)：MA01810)；甲酸、乙腈、甲醇：均為色譜純，購(gòu)自Sigma公司。(2)K3型酶標(biāo)儀、NanoDrop 8000型分光光度儀、Thermo Sorvall ST16型常溫離心機(jī)、Thermo Legend Micro型低溫離心機(jī)均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，KD-8D型電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏公司，ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀-TQ-D三重四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)及Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1×100 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLC?BEH C18保護(hù)柱(1.7 μm)均購(gòu)自Waters公司，超濾離心管(10 000 Da)購(gòu)自Millipore公司。

1.3.3 檢測(cè)方法：(1)樣品的前處理：取血漿500 μl，加入蛋白沉淀劑甲醇-乙腈(1 ∶3)溶液1 ml，渦旋2 min；常溫下1 000 r/min離心5 min，取上清約700 μl加入超濾管；常溫下10 000 r/min離心5 min；將樣品吸取至樣品瓶，待測(cè)。(2)采用高效液相聯(lián)合質(zhì)譜法檢測(cè)L-Arg及ADMA水平。液相色譜條件：采用ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)色譜柱，以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸甲醇溶液為流動(dòng)相B，按表2的條件進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.2 ml/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為5 μl。質(zhì)譜條件：采用ESI+正離子離子化模式,進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，毛細(xì)管電壓2.60 kV，離子源溫度為120℃，錐孔氣流量為150 L/h，脫溶劑氣溫度為450℃，脫溶劑氣流速為500 L/h，具體參數(shù)見表3。

表2 液相梯度洗脫條件

表3 化合物測(cè)定質(zhì)譜具體參數(shù)

1.4 肺功能測(cè)定 用藥前采用日本Chest公司Hi 198型肺功能測(cè)定儀對(duì)哮喘患者進(jìn)行肺功能檢測(cè)，觀察指標(biāo)包含1 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV1)、FEV1/用力肺活量的比值(FEV1/forced vital capacity ratio,FEV1/FVC)、呼氣流量峰值(peak expiratory flow,PEF)。檢查的注意事項(xiàng)：檢查時(shí)不用鼻呼氣，需用嘴呼吸，保證檢查過程中不漏氣。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 哮喘組與正常對(duì)照組血漿ADMA、L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值比較 兩組的血漿ADMA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，哮喘組的L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值均低于正常對(duì)照組(均P<0.05)，見表4。

表4 哮喘組與正常對(duì)照組血漿ADMA、L-Arg水平及L-Arg/ADMA比值比較(x±s)

2.2 不同程度臟腑虛損哮喘患者肺功能比較 肺氣虛組、肺脾氣虛組、肺脾腎虛組患者FEV1、FEV1/FVC、PEF均依次降低(均P<0.05)，見表5。

表5 不同程度臟腑虛損哮喘患者肺功能比較(x±s)

注：兩兩比較，均P<0.05。

2.3 不同程度臟腑虛損哮喘組與正常對(duì)照組血漿L-Arg、ADMA水平、L-Arg/ADMA比值比較 各臟腑虛損組的L-Arg水平、L-Arg/ADMA比值均低于正常對(duì)照組(均P<0.05)，但不同臟腑虛損哮喘組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。4組的ADMA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表6。

表6 不同程度臟腑虛損哮喘患者與正常對(duì)照組血漿L-Arg、ADMA水平及L-Arg/ADMA比值比較(x±s)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討 論

目前，有研究表明在心血管疾病等多種其他疾病中ADMA水平的升高可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能受損[15-18]。1型和2型糖尿病大鼠的血漿ADMA含量明顯升高，而反映心肌線粒體細(xì)胞色素C氧化酶與線粒體合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子——過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子-1α轉(zhuǎn)錄明顯減少；老年大鼠血漿內(nèi)源性ADMA水平升高，伴心肌線粒體生物合成減少，且兩者呈負(fù)相關(guān)，而外源性ADMA可直接抑制心肌細(xì)胞線粒體生物合成與三磷酸腺苷生成[19-20]，提示ADMA能導(dǎo)致心肌組織線粒體生物合成障礙，這與ADMA水平的升高而引起L-Arg/ADMA比例下降有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組血漿L-Arg水平及L-Arg/ADMA比例低于正常對(duì)照組(均P<0.05)，且各臟腑虛損組的L-Arg水平、L-Arg/ADMA比值亦均低于正常對(duì)照組(均P<0.05)。提示不同臟腑虛損的哮喘患者機(jī)體均存在精氨酸代謝紊亂、L-Arg/ADMA比例的失衡和NOS功能的受損，而這可能會(huì)影響線粒體功能。當(dāng)L-Arg水平下降時(shí)，L-Arg/NOS/NO通路(即NO的生成過程)的底物缺乏或不足，而由于L-Arg和ADMA存在相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOS的關(guān)系，此時(shí)ADMA處于相對(duì)剩余狀態(tài)，那么作為限速酶的NOS不能夠充分與L-Arg結(jié)合發(fā)揮其功能生成NO，就會(huì)被ADMA解耦聯(lián)產(chǎn)生大量的過氧亞硝酸陰離子而損傷線粒體呼吸鏈。并且目前相關(guān)研究已表明哮喘患者血漿NOS水平升高[21]，但正是由于L-Arg的不足而被大量解耦聯(lián)，L-Arg/ADMA比例的失衡正是反映了NOS的功能受損。因此，我們認(rèn)為L(zhǎng)-Arg/ADMA比例下降是引起哮喘患者線粒體呼吸鏈損傷、大量活性氧蓄積的重要原因；而造成哮喘患者機(jī)體內(nèi)L-Arg/ADMA比例失衡的根本原因可能是L-Arg的不足。但在本研究中，不同程度臟腑虛損哮喘患者精氨酸的代謝水平差異無統(tǒng)計(jì)意義。

中醫(yī)臟腑虛損理論認(rèn)為肺脾腎三臟虛損與哮喘發(fā)病的輕重程度密切相關(guān)，臟腑虛損狀況反映著病情嚴(yán)重程度，從發(fā)病之初的咳喘到呼吸衰竭的病情進(jìn)展過程中，存在著肺氣虛、肺脾氣虛、肺脾腎俱虛的證候演變和臟腑傳變規(guī)律，臟腑虛損狀況和傳變規(guī)律在某種程度上反映了病情的進(jìn)展趨勢(shì)[22-24]。本研究中，肺氣虛組、肺脾氣虛組、肺脾腎虛組患者FEV1、FEV1/FVC、PEF均依次降低(均P<0.05)，即隨臟腑虛損情況的加重，哮喘患者的肺功能下降。這提示肺脾腎三臟虛損狀況反映著病情的進(jìn)展趨勢(shì)，用臟腑虛損理論對(duì)臨床癥狀等外在表象的判斷進(jìn)行辨證分型對(duì)哮喘患者臨床病情進(jìn)展的估測(cè)有一定的可行性。

總之，不同程度臟腑虛損哮喘患者機(jī)體均存在精氨酸代謝紊亂、L-Arg/ADMA比例的失衡，這可能是引起哮喘患者線粒體呼吸鏈損傷、大量活性氧蓄積的重要原因；但不同程度臟腑虛損哮喘患者精氨酸的代謝水平并無差異。哮喘患者肺功能變化與臟腑虛損發(fā)展趨勢(shì)具有一致性。