增強(qiáng)馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定膠體篩選研究

鄭惠娜 ， 張 凱 ， 周春霞 ， 曹文紅 ， 高加龍 ， 鄭周彬 ，魏 薇 ， 秦小明 ， 章超樺

（1.廣州海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué) 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學(xué) 國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

食品加工過程中，熱處理是引起食品成分發(fā)生變性，導(dǎo)致食品物理化學(xué)特性發(fā)生改變的重要原因。動(dòng)物肌肉加工過程中，蛋白質(zhì)是最易受熱而發(fā)生變性的成分，并且相比于植物蛋白和陸地動(dòng)物蛋白，水產(chǎn)肌肉蛋白更為不穩(wěn)定，更易受熱而發(fā)生變性，大量研究顯示，肌肉蛋白經(jīng)過熱處理后其分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性等均會(huì)在加熱和受熱過程中發(fā)生明顯的變化[1-6]。因此，在食品加工過程中，為了防止蛋白質(zhì)因各種加工因素的影響，常常添加一些親水性膠體，這些膠體能與食品中的蛋白質(zhì)相互作用，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，質(zhì)地和物理化學(xué)性質(zhì)[7-11]。我國(guó)水產(chǎn)加工技術(shù)相對(duì)落后，特別是基礎(chǔ)研究起步較晚，水產(chǎn)資源及其副產(chǎn)品的加工利用率一直處于較低水平，導(dǎo)致長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)水產(chǎn)加工產(chǎn)品單一，高值化加工產(chǎn)品較少。因此，加強(qiáng)基礎(chǔ)性研究，提升水產(chǎn)高值化加工技術(shù)水平，對(duì)于充分開發(fā)和利用我國(guó)豐富的水產(chǎn)及副產(chǎn)品資源十分必要。作者以珍珠產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物馬氏珠母貝肉為研究對(duì)象，在前期研究結(jié)果基礎(chǔ)上[12]，篩選出有效提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩(wěn)定性親水膠體，并分析不同熱處理?xiàng)l件下最佳親水膠體分子對(duì)馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用馬氏珠母貝肉以及改善水產(chǎn)肌肉蛋白熱穩(wěn)定性，提高水產(chǎn)資源及副產(chǎn)品加工利用率、充分開發(fā)利用我國(guó)水產(chǎn)資源提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬氏珠母貝:購(gòu)于湛江雷州市珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 試劑與儀器

考馬斯亮藍(lán)試劑盒:購(gòu)于南京建成生物工程研究所；福林酚試劑盒，十二烷基苯磺酸鈉（SDS），三羥甲基氨基甲烷（Tris），溴酚藍(lán)，R-250考馬斯亮藍(lán):購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺（Acr-Bis），過硫酸銨，四甲基乙二胺（TEMED），電泳上層膠緩沖液，電泳下層膠緩沖液:購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；卡拉膠，果膠，瓜爾膠:購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，其余試劑均為分析純。

JA2003電子天平:上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JYL-F20絞肉機(jī):九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；T-18高速勻漿機(jī):德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；J-26S XP高速臺(tái)式冷凍離心機(jī):美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品；DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠制造；DYCZ-24DN雙垂直電泳槽:北京六一儀器廠制造；PHS-3C數(shù)顯pH酸度計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；UV-2550紫外可見分光光度計(jì):日本島津公司產(chǎn)品；DK-8D三孔三溫水浴鍋:常州諾基儀器有限公司產(chǎn)品；Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 馬氏珠母貝肉去殼，去內(nèi)臟取閉殼肌，清洗瀝干，每袋500 g分裝，置于-40℃凍藏備用。

1.3.2 水溶性蛋白質(zhì)的提取 水溶性蛋白質(zhì)提取參考文獻(xiàn)[12]略加修訂，取凍藏馬氏珠母貝肌肉于4℃下解凍16 h，稱取一定量貝肉絞肉機(jī)絞碎后，按照1 g∶4 mL比例加入超純水（4℃ 預(yù)冷），高速分散機(jī)勻漿3 min（冰浴條件下），然后10 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液為粗提馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)。進(jìn)一步按照50 g/dL比例加入硫酸銨，并于4℃靜置過夜后 10 000 r/min，4℃離心15 min，取沉淀，4℃下透析脫鹽直至采用BaCl2檢測(cè)無(wú)沉淀，既得馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)（WSP），進(jìn)一步冷凍干燥后獲得粉末狀水溶性蛋白質(zhì)（F-D WSP）。

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 樣品蛋白質(zhì)濃度采用福林酚試劑盒進(jìn)行測(cè)定。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.001 3x+0.001 3，R2=0.998，y為吸光值，x則為樣品濃度。

1.3.4 有效親水膠體的篩選 選取卡拉膠、果膠、瓜爾膠3種親水膠體，采用0.05 mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液將水溶性蛋白質(zhì)WSP配成1 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液。同時(shí)，將3種親水膠體配成1 mg/mL的膠體溶液，然后將蛋白質(zhì)溶液與膠體溶液以體積比10∶1的比例混合均勻，將10 mL混合液及蛋白溶液分裝于玻璃試管中，在 60、70、80、90、100 ℃ 溫度條件下分別水浴熱處理30 min，無(wú)添加膠體的蛋白質(zhì)溶液也在同樣熱處理?xiàng)l件進(jìn)行處理，樣品經(jīng)過熱處理后迅速冷卻至室溫，并于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定熱處理后蛋白質(zhì)溶液及蛋白質(zhì)膠體混合溶液吸光值A(chǔ)及A′，樣品的濁度以透光率T和T′表示。通過比較在同一熱處理溫度和加熱時(shí)間條件下，蛋白質(zhì)溶液濁度與蛋白質(zhì)膠體混合溶液濁度差異（透光率差值ΔT），篩選出有效提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩(wěn)定性親水膠體。根據(jù)下式計(jì)算ΔT%:

其中:A為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)溶液吸光值；A′為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)膠體混合溶液吸光值；T為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)溶液透光率；T′為熱處理后水溶性蛋白質(zhì)膠體混合溶液透光率。

1.3.5 有效親水膠體-蛋白質(zhì)混合體系熱處理 根據(jù)1.3.4篩選出最佳提高水溶性蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性親水膠體，采用0.05 mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液將WSP配成1 mg/mL（福林酚法定量）的蛋白質(zhì)溶液，D-F WSP溶解后先4 000 r/min離心5 min取上清液，福林酚法定量配成1 mg/mL蛋白質(zhì)溶液。根據(jù)1.3.4程序進(jìn)行熱處理，同時(shí)比較同樣熱處理?xiàng)l件下最佳親水膠體對(duì)WSP和D-F WSP蛋白質(zhì)溶液熱穩(wěn)定性的影響差異。

1.3.6 SDS-PAGE分析 將水溶性蛋白質(zhì)（WSP和F-D WSP）配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，按照樣品溶液:加樣緩沖液體積比例5∶1混合均勻后，水浴煮沸5 min。采用濃縮膠5 g/dL，分離膠12 g/dL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，先恒壓80 V分離30min后改為恒壓160 V分離直至條帶前沿電泳至接近分離膠底部處，關(guān)閉電源，小心取下凝膠，切除濃縮膠部分，采用考馬斯亮藍(lán)染色均勻后，脫色液脫色直至凝膠底色透明，出現(xiàn)清晰條帶，于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中成像分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析與處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5.0（GraphPad Software，Inc.La Jolla，CA USA）和 SPSS 22.0（IBM Inc.，NY，USA）進(jìn)行作圖分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD（n=3），多組數(shù)據(jù)之間采用單因素ANOVA進(jìn)行顯著性差異（P＜0.05）分析，兩組數(shù)據(jù)之間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異（P＜0.05）分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 有效親水膠體的篩選

肌肉蛋白可以根據(jù)溶解度的差異分為水溶性蛋白（又稱肌漿蛋白）、鹽溶性蛋白（又稱肌原纖維蛋白，主要是肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)球蛋白）和不溶性蛋白（又稱肌質(zhì)蛋白）[13]。前期研究結(jié)果顯示相對(duì)于鹽溶性蛋白，馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白的熱穩(wěn)定性較差[12]。

目前，親水膠體廣泛用于各種食品的加工過程中，其能夠通過增強(qiáng)食品組分凝膠特性、粘稠性、持水性等提高食品的加工特性?？ɡz、果膠及瓜爾膠是食品工業(yè)中常用的膠體種類，并且研究顯示這3種膠體對(duì)蛋白穩(wěn)定性起到一定作用[14-15]。作者通過測(cè)定不同溫度條件下3種膠體對(duì)馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)WSP的熱穩(wěn)定性的差異，篩選出最佳穩(wěn)定WSP的膠體種類，研究結(jié)果（見圖1）顯示:同一熱處理溫度條件下，3種膠體對(duì)WSP的熱穩(wěn)定性的影響存在明顯差異（P＜0.05），并且在熱處理溫度范圍內(nèi)（60～100℃），卡拉膠對(duì)于穩(wěn)定WSP的效果最好，添加卡拉膠能夠顯著降低WSP溶液在熱處理?xiàng)l件下的濁度值，提高WSP溶液的透光率。而效果相對(duì)較差的是果膠，瓜爾膠的穩(wěn)定效果最差。并且從圖中結(jié)果可以看出，隨著熱處理溫度的提高，ΔT逐漸增大，而這種趨勢(shì)在果膠及瓜爾膠數(shù)據(jù)結(jié)果中不明顯。蛋白質(zhì)的熱變性反應(yīng)十分復(fù)雜，隨著熱處理的條件及溫度不同會(huì)發(fā)生許多結(jié)構(gòu)變化，特別是各種熱處理?xiàng)l件對(duì)蛋白質(zhì)變性過程肽鏈的展開及蛋白質(zhì)凝聚反應(yīng)的強(qiáng)度不同，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在水溶液中發(fā)生熱變性時(shí)候，首先肽鏈展開后相互凝聚，蛋白質(zhì)溶液濁度提高，透光率減少，當(dāng)變性到一定程度時(shí)候，凝聚蛋白質(zhì)完全變性并在重力作用下發(fā)生沉淀，從而使溶解度下降[16-17]。研究結(jié)果顯示，在熱處理?xiàng)l件下，卡拉膠作為穩(wěn)定馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白WSP的效果最好。

圖1 不同溫度條件下3種親水膠體對(duì)水溶性蛋白WSP熱穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of three colloids on thermal stability of WSP at different

2.2 卡拉膠對(duì)水溶性蛋白熱穩(wěn)定性的影響

2.2.1 WSP與F-D WSP蛋白質(zhì)溶液組成差異比較貝肌肉水溶性蛋白質(zhì)主要含有肌漿蛋白、球蛋白和肌白蛋白，大多數(shù)的水溶性蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在1～10萬(wàn)范圍內(nèi)，分子形狀近似球形[18-19]。研究過程中發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后的水溶性蛋白質(zhì)F-D WSP的溶解性較差，難以完全溶解，因此，WSP與F-D WSP可溶蛋白質(zhì)溶液組成是否有所不同需要進(jìn)行分析。圖2比較了WSP和F-D WSP蛋白質(zhì)溶液的蛋白組成差異，從圖中結(jié)果分析:未經(jīng)過冷凍干燥的水溶性蛋白質(zhì)WSP條帶數(shù)較冷凍干燥的水溶性蛋白質(zhì)F-D WSP多，經(jīng)過冷凍干燥，能夠溶解于緩沖溶液中的F-D WSP蛋白質(zhì)條帶主要分布在 9.9×104、6.5×104、4.2×104、3.6×104以及 1.8×104附近。 而未經(jīng)過冷凍干燥的WSP水溶液蛋白條帶較多，并且與F-D WSP相比較，主要體現(xiàn)在 1.5×105及 8.0×104附近的相對(duì)分子質(zhì)量較大蛋白質(zhì)，這可能是由于冷凍干燥過程中相對(duì)分子質(zhì)量較大蛋白更容易發(fā)生冷凍變性從而溶解性大大降低，以至于冷凍干燥后在緩沖溶液中無(wú)法溶解。

圖2 WSP與F-D WSP蛋白溶液組成差異比較Fig.2 Comparison of the protein compositions between WSP and F-D WSP solution

圖3 60℃熱處理?xiàng)l件下卡拉膠對(duì)WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.3 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 60℃

2.2.2 卡拉膠對(duì)WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性的影響為進(jìn)一步研究卡拉膠對(duì)馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白的影響作用，作者同時(shí)比較了卡拉膠對(duì)未經(jīng)過冷凍干燥的水溶性蛋白質(zhì)WSP及冷凍干燥后的水溶性蛋白F-D WSP熱穩(wěn)定性影響作用的差異性，研究結(jié)果見圖3-圖7，從圖3及圖4結(jié)果分析，在60℃和70℃熱處理?xiàng)l件下及熱處理時(shí)間范圍內(nèi) （5～30 min）卡拉膠對(duì)F-D WSP和WSP的熱穩(wěn)定性作用存在明顯差異，在同一處理時(shí)間條件下，卡拉膠對(duì)F-D WSP的穩(wěn)定作用明顯優(yōu)于對(duì)WSP的穩(wěn)定作用，這可能是冷凍干燥后，水溶性蛋白質(zhì)本身已經(jīng)發(fā)生了一定的變性，親水性較差，溶解于水溶液中再經(jīng)過熱處理更容易發(fā)生凝聚，從而更不穩(wěn)定，這使得卡拉膠的穩(wěn)定作用尤為明顯，未經(jīng)過冷凍干燥處理的WSP蛋白質(zhì)在60℃及70℃條件下相對(duì)穩(wěn)定性較好。圖5結(jié)果顯示了80℃條件下，卡拉膠對(duì)WSP的穩(wěn)定作用開始增強(qiáng)，而對(duì)F-D WSP的穩(wěn)定作用有所減弱，并且隨著熱處理溫度的提高，卡拉膠對(duì)WSP的穩(wěn)定作用開始優(yōu)于對(duì)F-D WSP的穩(wěn)定作用。這可能是由于在較高溫條件下，經(jīng)過冷凍干燥處理的F-D WSP易于發(fā)生進(jìn)一步變性凝聚，此時(shí)卡拉膠的穩(wěn)定作用已經(jīng)不能較為有效抑制FD WSP熱變性進(jìn)程?？ɡz是一類多糖類物質(zhì)，各種類型的卡拉膠結(jié)構(gòu)中均含有大量的羥基。Fuente等研究顯示在卡拉膠存在條件下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的乳清蛋白溶液在pH7.0溶液中進(jìn)行熱處理，乳清蛋白不會(huì)失去其天然結(jié)構(gòu)，但是會(huì)引起加熱過程中所形成的可溶性聚集物相對(duì)分子質(zhì)量降低[20]。Kelly等研究也顯示，卡拉膠的存在不影響在75℃時(shí)加熱的乳清蛋白的聚集，然而，在較高溫度下，卡拉膠的存在對(duì)乳清分離蛋白的聚集產(chǎn)生較大影響[21]。蛋白質(zhì)種類及存在的狀態(tài)不同，卡拉膠與其相互作用的機(jī)制也不同，整體分析，隨著熱處理溫度的不斷提高，卡拉膠對(duì)未經(jīng)過冷凍干燥處理的WSP穩(wěn)定性作用逐漸增強(qiáng)，而對(duì)經(jīng)過冷凍干燥處理的F-D WSP的穩(wěn)定性作用則呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。

圖4 70℃熱處理?xiàng)l件下卡拉膠對(duì)WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.4 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 70℃

圖5 80℃熱處理?xiàng)l件下卡拉膠對(duì)WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 80℃

圖6 90℃熱處理?xiàng)l件下卡拉膠對(duì)WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 90℃

圖7 100℃熱處理?xiàng)l件下卡拉膠對(duì)WSP及F-D WSP熱穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of Carrageenan on thermal stability of WSP and F-D WSP under 100℃

3 結(jié) 語(yǔ)

親水膠體卡拉膠、果膠及瓜爾膠對(duì)提高馬氏珠母貝肌肉水溶性蛋白熱穩(wěn)定性具有一定的作用，其中卡拉膠的穩(wěn)定性作用效果最佳。經(jīng)過冷凍干燥后的水溶性蛋白溶液的蛋白組成與未經(jīng)過冷凍干燥的水溶性蛋白溶液蛋白組成存在一定差異，同時(shí)卡拉膠對(duì)其穩(wěn)定性作用也存在差異，在熱處理?xiàng)l件下，隨著熱處理溫度的不斷提高，卡拉膠對(duì)未經(jīng)過冷凍干燥處理的WSP穩(wěn)定性作用逐漸增強(qiáng)，而對(duì)經(jīng)過冷凍干燥處理的F-D WSP的穩(wěn)定性作用則呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。