牛奶中阿莫西林含量表面增強拉曼光譜檢測方法的建立

李海閩 梁 琪 陳衛(wèi)平 杜 娟

(江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045)

阿莫西林(Amoxicillin)是一種廣譜的半合成青霉素類抗生素藥物，因起效快、殺菌效果好在醫(yī)學和獸醫(yī)臨床得到廣泛應(yīng)用[1]。但由于能產(chǎn)生過敏反應(yīng)和易使細菌產(chǎn)生耐藥性等，所以對阿莫西林含量的測定是必要的。阿莫西林含量的測定方法有多種，如分光光度法、免疫分析法、色譜分析法、色譜質(zhì)譜連用法、電化學法、微生物法等[1-4]，但這些方法測定程序復(fù)雜、時間長且成本較高。阿莫西林有較強的抗菌能力，常被作為飼料添加劑或獸藥在禽畜養(yǎng)殖中使用，但它的殘留會引起易敏感人群過敏，且經(jīng)常食用有殘留阿莫西林的食品會誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株，給人類帶來潛在危害。常用的測定阿莫西林含量的方法，處理樣品步驟繁瑣，應(yīng)用儀器多，試驗成本高，耗時長，不適用于樣品中阿莫西林含量的簡便與快速檢測[5]。

表面增強拉曼散射(SERS)檢測技術(shù)可用于固體、液體、氣體等樣品的分析和檢測，具有光譜特征強、受光漂白影響小、檢測靈敏度高等優(yōu)點[6]。近年來，SERS檢測技術(shù)已成為了研究的熱點，被廣泛應(yīng)用于食品中有害物質(zhì)的檢測。近期SERS檢測技術(shù)在食品中的應(yīng)用有：房小倩等[7]同時檢測了雞尾酒中的苯甲酸鈉和山梨酸鉀，其預(yù)測值與實際值相關(guān)系數(shù)分別為0.949 3和0.921 8；李韋等[8]快速檢測了腐竹和米粉中烏洛托品，其最低檢出限可達到0.5 μg/mL，檢測時間低于20 min；李言等[9]檢測了食品中赤蘚紅，其最低檢出限可達到1 μg/mL，檢測時間低于15 min；許麗梅等[10]快速檢測了食品中羅丹明B，其最低檢出限可達到0.5 mg/kg，檢測時間約10 min；陳思等[11-12]快速檢測了硬糖中誘惑紅和白酒中糖精鈉，其最低檢出限分別可達到0.1 g/kg和1 μg/mL，檢測時間分別低于15，10 min。

本試驗建立了牛奶中阿莫西林含量的SERS檢測方法。通過優(yōu)化得到了最佳檢測條件，并成功用于牛奶中阿莫西林含量的測定。該方法簡單方便，為SERS檢測技術(shù)應(yīng)用到食品中有害物質(zhì)的檢測提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

阿莫西林：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

硝酸銀：分析純，上海試劑一廠；

氫氧化鈉、乙酸乙酯、氯化鈉：分析純，天津永大化學試劑有限公司；

錫紙、牛奶：市售；

試驗所用水都為超純水，所有試劑和藥品使用時未進一步提純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；

高速冷凍離心機：HC-2518R型，德國耶拿分析儀器股份公司；

予華牌循環(huán)水真空泵：SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

激光共焦顯微拉曼光譜儀：DXR型，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶膠的制備 準確稱取10 mg香水百合花瓣粉末于250 mL圓底燒瓶中，加入20 mL超純水，再加5 mmol/L 硝酸銀溶液5 mL，用4%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至12，放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中于37 ℃加熱12 h后抽濾，濾液備用。

1.2.2 SERS檢測條件優(yōu)化 阿莫西林標準溶液制備：精確稱取阿莫西林標準品25.000 mg于25 mL容量瓶中，加超純水溶解，定容，得到濃度為1 000 μg/mL的阿莫西林標準儲備液。用超純水依次稀釋成梯度標準液：500，100，50，10，1 μg/mL，密封，低溫(4 ℃)保存。

將適量的銀溶膠與阿莫西林溶液混合，總體積為1 mL，旋渦混勻后吸取20 μL滴至包有錫箔紙的玻璃片上，35 ℃烘箱中烘干后進行SERS檢測。按此步驟分別對銀溶膠的濃度(10.60，26.51，53.02，106.04，212.08 μg/mL)、銀溶膠與阿莫西林溶液的體積比(1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1)、是否添加氯化鈉進行了條件優(yōu)化。

激光共焦顯微拉曼光譜儀檢測參數(shù)為：激光波長，785 nm；激光能量，30.0 mW；光闌，50 μm針孔；積分時間為10 s，每個樣品探測6次進行平均。

1.2.3 牛奶樣品檢測 以不含抗生素的牛奶為溶劑配制濃度為100 μg/mL的阿莫西林樣品溶液。取500 μL樣品溶液與500 μL乙酸乙酯置于2 mL離心管中水浴超聲10 min后取出，10 000 r/min離心10 min。按照上述步驟優(yōu)化的最佳SERS檢測條件對樣品進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Excel和Origin 8.5分析軟件結(jié)合進行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀溶膠的表征

圖1是香水百合花瓣粉末綠色合成的銀溶膠的紫外吸收光譜及透射電鏡圖，如紫外吸收光譜圖所示，香水百合花瓣粉末綠色合成的銀溶膠在410 nm處有最大吸收峰，半峰寬較窄，對稱度高，說明合成的銀納米粒徑分布均勻，分散性良好。從透射電鏡圖可以看出銀納米顆粒是不規(guī)則的球狀，平均粒徑大小為(6.581±1.306) nm。

圖1 銀溶膠的紫外吸收光譜及透射電鏡圖

Figure 1 Ultraviolet absorption spectrum and transmission electron micrograph of silver colloid solution

2.2 阿莫西林拉曼光譜

分別測試了水、阿莫西林水溶液及阿莫西林固體的拉曼光譜，結(jié)果如圖2所示。超純水沒有明顯的拉曼峰，且在沒有活性基底的條件下，100 μg/mL的阿莫西林水溶液也沒有拉曼峰，但固體阿莫西林在854，955，1 055，1 178，1 261，1 399，1 620，1 685，1 776 cm-1等處有主要特征峰。據(jù)相關(guān)文獻[13-14]報道，這些峰均是阿莫西林的特征峰。這表明無活性基底的增強作用，阿莫西林標準溶液無SERS信號。表1為阿莫西林的理論拉曼光譜與試驗拉曼光譜，二者基本一致。阿莫西林分子有多種官能團，如表1所示，854 cm-1歸屬于苯環(huán)的呼吸振動與CH、NH2的彎曲振動；955 cm-1歸屬于CH3的平面搖擺振動與苯環(huán)中CH的面外彎曲振動；1 055 cm-1歸屬于C—NH2的伸縮振動與CH、NH2的彎曲振動；1 178 cm-1歸屬于NH2、CH及與苯環(huán)相連的OH的彎曲振動；1 261 cm-1歸屬于C—OH的伸縮振動和苯環(huán)中CH的彎曲振動；1 399 cm-1歸屬于NH2的扭曲振動與CH的彎曲振動；1 620 cm-1歸屬于苯環(huán)中C═C的伸縮振動與NH的彎曲振動；1 776 cm-1歸屬于羧基中C═O的伸縮振動、OH的彎曲振動與噻唑環(huán)中CH的彎曲振動。

2.3 SERS檢測條件優(yōu)化

2.3.1 銀溶膠濃度的條件優(yōu)化 SERS信號的強弱與基底的活性密切相關(guān)。圖3為以不同濃度的銀溶膠為基底時阿莫西林的拉曼增強光譜圖。如圖3所示，增強基底沒有出現(xiàn)拉曼峰，說明香水百合花瓣粉末綠色合成的銀溶膠不會對所測溶液信號產(chǎn)生影響。銀溶膠與1 000 μg/mL阿莫西林溶液混合時，當銀溶膠濃度從10.60 μg/mL增加到53.02 μg/mL，拉曼光譜振動峰不明顯，可能是銀溶膠的濃度太低，導(dǎo)致活性較低；當銀溶膠濃度為106.04，212.08 μg/mL時，拉曼光譜振動峰明顯，且106.04 μg/mL時SERS信號強度最大，故106.04 μg/mL為最佳濃度。

a. 阿莫西林固體 b. 100 μg/mL阿莫西林水溶液 c. 水

Table 1 The experimental and theoretical Raman spectra of amoxicillin and peak assignment[13-14]

理論光譜/cm-1試驗光譜/cm-1峰歸屬843854苯環(huán)的呼吸振動,CH、NH2的彎曲振動953955CH3的平面搖擺振動與苯環(huán)中CH的面外彎曲振動1 0601 055C—NH2的伸縮振動與CH、NH2的彎曲振動1 1851 178NH2、CH及與苯環(huán)相連的OH的彎曲振動1 2411 261C—OH的伸縮振動和苯環(huán)中CH的彎曲振動1 4131 399NH2的扭曲振動與CH的彎曲振動1 6651 620苯環(huán)中C═C的伸縮振動與NH的彎曲振動1 7871 776羧基中C═O的伸縮振動、OH的彎曲振動,噻唑環(huán)中CH的彎曲振動

a. 106.04 μg/mL銀溶膠 b、c、d、e、f. 分別為10.60，26.51，53.02，106.04，212.08 μg/mL銀溶膠 + 1 000 μg/mL阿莫西林溶液(各500 μL)

圖3 不同濃度的銀溶膠為基底時對阿莫西林的拉曼增強光譜圖

Figure 3 Raman enhanced spectra of amoxicillin with different concentrations of silver colloid solution as substrate

2.3.2 溶膠與阿莫西林溶液的體積比條件優(yōu)化 當基底間距適當時，若能有更多分子可以吸附至基底的活性位點，分子的拉曼信號會得到更大增強。但當分子對活性位點的吸附達到飽和時，SERS信號很難繼續(xù)增強。圖4是不同體積比的銀溶膠與阿莫西林的拉曼增強光譜圖。如圖4所示，當銀溶膠與阿莫西林溶液體積比為1∶4和1∶2時，雖有阿莫西林的拉曼特征峰，但拉曼信號強度較弱，可能阿莫西林濃度較高但銀溶膠基底的活性位點較少；當體積比為 4∶1時，拉曼強度達到最大，可能基底的活性位點與阿莫西林溶液濃度比例最佳，故選擇4∶1為最優(yōu)體積比。

圖4 不同體積比的銀溶膠與阿莫西林的拉曼增強光譜圖

Figure 4 Raman enhanced spectra of silver colloid solution and amoxicillin in different volume ratios

2.3.3 氯化鈉對銀溶膠與阿莫西林體系的影響 鹽的添加及加入順序?qū)鰪娦Ч灿杏绊慬15]。圖5為氯化鈉對銀溶膠與阿莫西林體系影響的拉曼增強光譜圖。當銀溶膠為活性基底時，氯化鈉的拉曼光譜在731，1 333 cm-1處有明顯的SERS信號。先加入氯化鈉，再加入阿莫西林的混合液的拉曼增強光譜與不加入阿莫西林的出峰情況差不多，但當加入的順序調(diào)整后，在854，955，1 055，1 261，1 399 cm-1處出現(xiàn)了阿莫西林的拉曼特征峰。這表明銀溶膠與阿莫西林結(jié)合后，再加入氯化鈉對阿莫西林的拉曼增強效果更好。然而同等條件下不添加氯化鈉時，拉曼特征峰處的SERS信號更強，所以選擇在體系中不添加氯化鈉。

綜上所述，當銀溶膠濃度為106.04 μg/mL、銀溶膠與阿莫西林溶液的體積比為4∶1且不添加氯化鈉的條件下，對阿莫西林的拉曼增強效果最好，SERS信號最強。

a. 銀溶膠+氯化鈉 b. 銀溶膠+氯化鈉+阿莫西林 c. 銀溶膠+阿莫西林+氯化鈉 d. 銀溶膠+阿莫西林

圖5 氯化鈉對阿莫西林與銀溶膠體系影響的拉曼增強光譜圖

Figure 5 Raman enhanced spectra of the effect of sodium chloride on the system of amoxicillin and silver colloid solution

2.4 阿莫西林標準溶液的SERS分析

圖6是不同濃度的阿莫西林標準溶液的表面增強拉曼光譜圖。當濃度為1 μg/mL時，阿莫西林的拉曼特征峰出現(xiàn)，且1 055 cm-1處的SERS信號強度與阿莫西林標準溶液濃度具有更好的正相關(guān)性。以阿莫西林標準溶液的濃度為橫坐標，在1 055 cm-1處的SERS信號強度為縱坐標建立線性回歸曲線。線性回歸方程為y=0.218x+18.228，且有良好的線性相關(guān)性(R2=0.985 8)，該方法的最低檢出限濃度可達到1 μg/mL。

圖6 不同濃度阿莫西林標準溶液的拉曼增強光譜圖Figure 6 SERS spectra of amoxicillin solution in different concentrations

2.5 牛奶中阿莫西林的SERS檢測

取3份阿莫西林濃度為100 μg/mL的牛奶樣品，測定其SERS信號強度，并計算回收率，結(jié)果見表2。如表2所示，牛奶樣品中阿莫西林的加標回收率為84.51%～93.62%，相對標準偏差(RSD)為5.16%，表明該方法可以滿足定量分析的要求，可用于牛奶中的阿莫西林含量的檢測。

表2 阿莫西林的回收率

3 結(jié)論

本試驗建立了牛奶中阿莫西林含量的SERS檢測方法。通過優(yōu)化確定了銀溶膠的最佳濃度、銀溶膠與阿莫西林溶液的最佳體積比和是否添加氯化鈉。結(jié)果表明，在最佳檢測條件下，阿莫西林標準溶液的濃度與SERS信號強度在1～1 000 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.218x+18.228，R2=0.985 8。該方法的最低檢出限可達到1 μg/mL。并且，3份加標牛奶中阿莫西林的加標回收率在84.51%～93.62%，RSD為5.16%。本試驗所用銀溶膠為生物合成，較常用的化學合成對環(huán)境無污染。因此該檢測方法簡單，環(huán)保，成本低，耗時短，靈敏度高，具有可行性。后續(xù)試驗可以建立食品中其它獸藥的SERS檢測方法。