結(jié)核分枝桿菌多表位診斷抗原的制備

高健，趙鼎

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結(jié)核分枝桿菌多表位診斷抗原的制備

高健1, 2, 3，趙鼎1, 2, 3

1 鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 檢驗科， 河南 鄭州 450000 2 鄭州兒童醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450000 3 河南省兒童醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450000

高健, 趙鼎. 結(jié)核分枝桿菌多表位診斷抗原的制備. 生物工程學報, 2019, 35(4): 718–725.Gao J, Zhao D. Preparation of multi-epitope recombinant diagnostic antigen of Mycobacterium tuberculosis. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 718–725.

將結(jié)核分枝桿菌 (，Mtb) 多個B細胞預測表位串聯(lián)表達 (命名為B102)，并初步評價其作為診斷抗原的血清學診斷價值。將Mtb PstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6個蛋白的11個B細胞預測表位串聯(lián)，加入合適的連接臂后全基因合成；將多表位片段插入帶有TRX標簽的表達質(zhì)粒中，在大腸桿菌BL21 (DE3) 中誘導表達，并利用Ni2+-Chelating親和層析和DEAE陰離子交換層析純化目的蛋白；利用Western blotting (WB) 技術對目的蛋白抗原性進行鑒定，并建立Mtb抗體檢測競爭法ELISA技術，初步評價此方法對陰陽血清樣本的鑒別能力。目的蛋白以包涵體形式存在，其表達量約占菌體總蛋白的31.25%，經(jīng)純化及復性后蛋白B102可溶性存在，濃度為3.124 mg/mL，純度為96.71%；WB實驗表明目的蛋白能與Mtb陽性血清相應抗體發(fā)生反應。對60份Mtb陽性血清及60份Mtb陰性血清進行檢測得出其靈敏度為90.00%，特異性為93.33%，陽性預測值為93.10%，陰性預測值為90.32%，符合率為91.67%，McNemer檢驗的結(jié)果提示與“金標準”診斷結(jié)果無差異，Kappa=0.833，提示兩種方法診斷結(jié)果一致性優(yōu)異。原核表達與層析純化可以獲取抗原性優(yōu)異的Mtb多表位診斷抗原，作為診斷抗原可以應用于Mtb的血清學檢測中。

多表位抗原，結(jié)核分枝桿菌，原核表達，層析純化，血清學診斷

結(jié)核病(Tuberculosis，TB) 嚴重危害人類健康，我國是全球第三大結(jié)核病高負擔國家[1]，隨著耐藥結(jié)核日趨嚴重，結(jié)核病的預防控制勢在必行。缺乏理想的診斷技術是其防控的主要難題。目前結(jié)核病的診斷以細菌學檢查為“金標準”，主要包括痰涂片鏡檢法與痰結(jié)核菌培養(yǎng)法，但存在對樣本質(zhì)量要求高、涂片靈敏度低、培養(yǎng)耗時長、操作誤差較大、不易標準化且無法區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌等問題[2]。皮膚結(jié)核菌素試驗很難將結(jié)核菌活動感染和潛伏感染以及卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG) 免疫個體區(qū)分開來[3]。分子檢測技術如PCR、核酸探針、生物芯片、蛋白芯片等技術操作復雜，對檢測儀器依賴性高，需要專業(yè)技術人員，不適宜用于大樣本檢測[4]。結(jié)核分枝桿菌(，Mtb) 免疫學診斷技術由于簡便、快捷、成本低、靈敏性和特異性較高廣泛用于結(jié)核病的早期診斷[5]。目前市面上血清學診斷試劑盒敏感性和特異性存在很大差異，分別為10%–90%和47%–100%[6]。因此篩選結(jié)核分枝桿菌高靈敏性和高特異性抗原成分，是解決結(jié)核病早期發(fā)現(xiàn)、快速診斷的關鍵途徑。研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用一種Mtb蛋白，由于單一抗體含量低或/和單一抗原分期出現(xiàn)，診斷價值不高[7–9]。也有研究表達多個蛋白，將其混合后作為診斷抗原，大大提高其診斷價值[10-12]。本研究根據(jù)篩選出通過基因工程技術表達Mtb PstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6個蛋白的11個B細胞預測表位串聯(lián)表達，并采用Western blotting和ELISA技術對其抗原性及診斷潛能進行初步評價，以期為結(jié)核病早期診斷和疫苗研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞及TRX載體購自北京全式金生物技術有限公司。限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ以及T4 DNA連接酶購自美國NEB公司。TMB底物溶液購自天根生化科技有限公司。Chelating Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)購自美國GE公司。Goat anti-human IgG-HRP conjugate均購自美國Merck Millipore公司。Mtb陽性血清60份分別來自河南省兒童醫(yī)院(34份)、鄭州大學附屬兒童醫(yī)院(20份) 及鄭州兒童醫(yī)院(6份) 結(jié)核病患者(年齡3–27歲)，陰性血清60份為普通門診血樣(年齡2–19歲) 由河南省兒童醫(yī)院提供。陰陽性血清樣本都經(jīng)過臨床和實驗室確診，以肺結(jié)核患者痰細菌學檢測結(jié)果(痰涂片和/或痰培養(yǎng)陽性)、影像學結(jié)果、結(jié)核菌素試驗結(jié)果及核酸檢測結(jié)果為金標準，即4項皆為陽性結(jié)果定為陽性血清，4項皆為陰性結(jié)果定為陰性血清。

1.2 表達質(zhì)粒B102的構(gòu)建

根據(jù)參考文獻[7]，將Mtb Pst1 aa 58–73 & aa 176–206 & aa 337–362、ESTA6 aa 15–30 & aa 44–59、CFP10 aa 18–33 & aa 60–84、Ag85B aa 119–134、Ag85A aa 214–230以及PPE54 aa 422–438 & aa 1825–1851用GGGS連接臂進行串聯(lián)，然后根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好表優(yōu)化基因并在5′端添加Ⅰ酶切位點序列，3′端添加Ⅰ酶切位點序列，最后交由TaKaRa全基因合成(將基因片段命名為B102F)。用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ處理包含B102F的pMD19-T-B102F質(zhì)粒(全基因合成產(chǎn)物)，將B102F酶切下來，連接到相同酶切處理的TRX表達載體上，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞。次日挑取單克隆菌落進行小量誘導表達，提取陽性表達克隆質(zhì)粒進行測序和雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為B102質(zhì)粒。

1.3 蛋白B102的制備

將轉(zhuǎn)化B102質(zhì)粒的BL21 (DE3) 接種于含氨芐霉素(50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基(10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母提取液，10 g/L NaCl) 中，培養(yǎng)適當時間后IPTG誘導表達目的蛋白(34 ℃， 4 h, 2 L)。離心收集表達菌(4 000 r/min，8 min，10 ℃)。用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，0.3% Triton X-100，pH 8.0) 重懸表達菌后用超聲儀破碎(功率250 W，超聲工作時間10 s，間歇時間20 s，共40個循環(huán))，離心(12 000 r/min，8 min，10 ℃)棄去上清。沉淀再次用緩沖液A重懸后離心回收(10 000 r/min，8 min，8 ℃)。用5 mL雙蒸水重懸沉淀，逐滴加入到緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，7 mol/L鹽酸胍，pH 8.0) 中并不斷攪拌直至溶液澄清。離心(12 000 r/min，8 min，8 ℃) 收集上清。將此上清上樣于用緩沖液B平衡的Chelating Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)中。首先用60 mmol/L咪唑(溶于緩沖液B中) 進行洗脫，然后用緩沖液C (20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)再次平衡層析介質(zhì)，然后用300 mmol/L咪唑(溶于緩沖液C中) 進行洗脫。取300 mmol/L洗脫液于緩沖液C中進行透析去掉咪唑成分。DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)用緩沖液C平衡后上樣，分別用0、100、200、400 mmol/L NaCl (溶于緩沖液C中) 進行梯度洗脫并收集相應洗脫液。分別取樣SDS-PAGE檢測目的蛋白的含量以及分布情況。將目的蛋白含量最高。純度最好的洗脫液于PBS (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4) 中徹底透析后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白B102的Western blotting分析

上樣10 μL蛋白B102溶液在13.5% SDS-PAGE中電泳(恒流35 mA，60 min)，然后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(NC) 上(恒壓12 V，35 min)。室溫，封閉液(3%脫脂奶粉溶解于PBST)處理NC膜2 h。加入封閉液稀釋的Mtb陽性血清(1∶20)、Mtb陰性血清(1∶20)，常溫孵育1 h后用PBST洗膜5次。檢測抗體都為Goat anti-human IgG-HRP conjugate (1∶5 000；Merck Millipore)，常溫孵育1 h后PBST洗膜5次，最后DAB顯色，清水終止顯色。

1.5 蛋白B102診斷效能的評價

利用蛋白B102建立血清Mtb抗體診斷競爭法ELISA試劑盒，并對臨床和實驗室確診的血清樣本進行檢測，評價試劑盒對陰陽性血清標本的鑒別能力。簡言之，碳酸鹽包被緩沖液稀釋蛋白B102 (1∶3 000) 后每孔100 μL (1.041 μg/mL) 包被板條孔，200 μL封閉液封閉非特異性位點；加入待測血清100 μL (1∶100稀釋)，置37 ℃孵育 1 h，然后洗滌；加入100 μL B102-HRP conjugate (1∶6 000；高碘酸鹽偶聯(lián)法；1.852 μg/mL)，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌；加入100 μL TMB顯色，參考基線波長為620 nm，用酶標儀測定波長為450 nm吸光度值(值)。

1.6 統(tǒng)計學分析

運用GraphPad Prism 7.00軟件分析120份血清樣本的值，繪制Mtb陽性血清與陰性血清抗體水平散點圖，并進行檢驗比較兩組血清水平差異。根據(jù)經(jīng)驗選取陰性血清值均值2.1倍作為最佳臨界值(Cut-off value) 并以此判定檢測試劑盒的靈敏度和特異性。用McNemer檢驗及Kappa一致性檢驗評價兩種檢測方法的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達和層析純化可獲取高度均質(zhì)的蛋白B102

B102的構(gòu)建如圖1A所示，融合蛋白的氨基端為TRX標簽，緊跟著依次為PstS1 (3個表位)、ESAT6 (2個表位)、CFP10 (2個表位)、Ag85B (1個表位)、Ag85A (1個表位) 以及PPE54 (2個表位) 等6個蛋白的11個B細胞預測表位，羧基端為His標簽，間隔中添加了連接臂GGGS以及合適的酶切位點(如Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ)。全基因合成的多表位基因片段長度約773 bp (圖1B)，構(gòu)建好的表達質(zhì)粒經(jīng)測序、小量表達(圖2A) 和雙酶切鑒定結(jié)果(圖1C) 證實構(gòu)建成功，并將正確質(zhì)粒命名為B102質(zhì)粒。

3個轉(zhuǎn)化B102質(zhì)粒的BL21 (DE3) 單克隆菌落小量表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在約40 kDa處有明顯表達條帶(圖2A)，表明B102蛋白可以在大腸桿菌中有效表達。但是蛋白B102主要以包涵體形式存在(圖2B)，占菌體總蛋白比例達到31.25%。將包涵體進行處理后利用His親和層析進行純化，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白B102主要存在于300 mmol/L咪唑洗脫液中(圖2B)，純度為94.25%，濃度為2.313 mg/mL。經(jīng)過DEAE陰離子交換層析后，蛋白B102主要分布于200 mmol/LNaCl洗脫液中，純度為96.71%，濃度為3.124 mg/mL (圖2B)。

圖1 B102表達質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 蛋白B102可以與Mtb陽性血清發(fā)生特異性反應

利用Western blotting技術對蛋白B102的抗原性進行初步鑒定，結(jié)果顯示，利用Mtb陽性血清作為捕獲抗體，抗人IgG-HRP作為檢測抗體，在NC膜上相應位置出現(xiàn)了明顯條帶(圖3A)；而Mtb陰性血清作為捕獲抗體，在NC膜上相應位置沒有出現(xiàn)對應條帶。并且無論是用Mtb陽性血清還是陰性血清，無蛋白B102表達菌及TRX空載體表達菌都未見明顯條帶(圖3，泳道1-2)，表 明了蛋白B102可以與Mtb陽性血清發(fā)生特異性反應。

圖2 蛋白B102小量表達(A) 和親和層析及陰離子交換層析純化結(jié)果(B)

圖3 蛋白B102的Western blotting分析

2.3 基于蛋白B102的競爭法ELISA技術可以很好地鑒別Mtb陰陽性血清標本

3 討論

一直以來結(jié)核分枝桿菌感染的血清學診斷是科研難題，病人不同的疾病進程、潛伏及細胞內(nèi)感染的特性、相對繁多的結(jié)構(gòu)及非結(jié)構(gòu)蛋白等使Mtb的免疫學指標紛呈復雜。目前有很多Mtb抗原如MPT-64、Ag85復合物和CFP-10/ ESAT-6等用于血清學診斷和疫苗研究，但靈敏度或特異性都不理想[5,13-14]。本研究根據(jù)B細胞表位預測篩選出Mtb6個蛋白的11個表位并將多表位展示在一個蛋白上，旨在構(gòu)建表位依賴性Mtb診斷抗原。

圖4 蛋白B102在Mtb感染血清學診斷效果評價

所選取的6個蛋白分別為PstS1 (3個表位)、ESAT6 (2個表位)、CFP10 (2個表位)、Ag85B (1個表位)、Ag85A (1個表位) 以及PPE54 (2個表位)。PsttS1、Ag85A、Ag85B、ESAT-6、CFP10是感染早期大量表達的分泌蛋白[15]。PE/PPE蛋白家族為分枝桿菌所獨有，且是結(jié)核分枝桿菌基因組中一個數(shù)量龐大的家族，對分枝桿菌的內(nèi)穩(wěn)態(tài)保持、繁殖及不同環(huán)境下的生存影響有著巨大的研究潛力。而且PE/PPE蛋白作為毒力因子對抗原加工遞呈、診斷抗原和疫苗研究等方面意義重大[16]。因此本研究選用了PPE54蛋白兩個抗原性預測值較高的表位。PstS1是結(jié)核菌的主要免疫原，何秀云等發(fā)現(xiàn)此抗原檢測的特異性明顯高于PPD[17]。ESAT6和CFP10無論在Mtb的顯性感染、隱性感染還是在與HIV合并感染中都具有較好的特異性和敏感性。當與PstS1蛋白聯(lián)合應用時，CFP10能檢測出對PstS1抗原缺乏反應的結(jié)核病患者血清特異性抗體，在保持高特異性的基礎上，可以彌補PstS1蛋白對涂片陰性結(jié)核病患者檢測敏感性的不足[18]。Ag85復合物在活動性肺結(jié)核病患者血清中高50–150倍，對活動性結(jié)核病輔助診斷具有重要意義[19]。將這6種蛋白的優(yōu)勢表位進行串聯(lián)進而構(gòu)建出新型Mtb診斷抗原。本研究發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在(圖2B)，但純化后經(jīng)過透析復性，目的蛋白水溶性程度很高，主要原因有：1) TRX融合表達能提高目的蛋白的可溶性，對目的蛋白的復性可能也有幫助作用[20]；2)所選擇的B細胞預測表位為線性表位同時也是T細胞表位，對蛋白構(gòu)象的要求相對較低；3)預測表位親水程度高，容易水溶。Western blotting結(jié)果顯示蛋白B102可以與Mtb陽性血清發(fā)生特異性反應，理論上可以與存在表位對應的所有抗體反應，說明了其抗原性優(yōu)異。

本研究采用競爭法同時檢測血清中Mtb相關IgG、IgM和IgA。在Mtb感染早期，患者體內(nèi)抗體以IgM為主，中晚期以IgG型為主，而潛伏感染者及感染愈后患者體內(nèi)一定時間內(nèi)存在大量IgG抗體。有研究發(fā)現(xiàn)大量樣本檢測[21]，IgM陽性率很低，大部分為IgG陽性，而本研究采用的是競爭法ELISA，可以同時檢測IgG和IgM兩種血清學指標，IgM抗體檢測可以補充IgG檢測只針對結(jié)核病中晚期的局限性，為結(jié)核病的早期診斷提供依據(jù)，針對不同的患者和不同的病程，同時檢測兩種抗體在結(jié)核病的診斷中意義重大[21]。IgA為粘膜免疫指標，血清中IgA也是一個重要診斷指標。本研究發(fā)現(xiàn)可以同時檢測這3種抗體的新型診斷試劑的靈敏度和特異性都很理想，下一步需要精細優(yōu)化包被抗原和酶偶聯(lián)抗原含量，靈敏度和特異性可能會有所提升。

總之，原核表達和層析純化獲取的多表位串聯(lián)診斷抗原，可以很好地鑒別Mtb陰陽性血清，為結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷和治療提供有效的血清學依據(jù)，為結(jié)核防控工作提供更真實的決策指標。

[1] WHO. Global tuberculosis report 2017. Washington, DC: WHO, 2017.

[2] Steingart KR, Ramsay A, Pai M. Optimizing sputum smear microscopy for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Expert Rev Anti-Infect Therapy, 2007, 5(3): 327–331.

[3] Diel R. Long-term effect of bacille calmette-Guérin vaccination in tuberculin skin testing: a new reality for TB prevention. Chest, 2017, 152(2): 235–236.

[4] Casela M, Cerqueira SMA, de Oliveira Casela T, et al. Rapid molecular test for tuberculosis: impact of its routine use at a referral hospital. J Bras Pneumol, 2018, 44(2): 112–117.

[5] Bekmurzayeva A, Sypabekova M, Kanayeva D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of. Tuberculosis, 2013, 93(4): 381–388.

[6] Steingart KR, Henry M, Laal S, et al. Commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review. PLoS Med, 2007, 4(6): e202.

[7] Nguyen TLT, Sarmiento ME, Calero R, et al. Immunoinformatics study on highly expressedgenes during infection. Tuberculosis, 2014, 94(5): 475–481.

[8] Zhu ZY, Zhang D, Wang HB, et al. Expression and serological diagnosis of Mycobacterium tuberculosis CFP-10 and Rv2626c proteins. Genet Mol Res, 2014, 13(3): 7398–7406.

[9] Luo Q, Li SJ, Xiao TY, et al. Cloning expression and serological evaluation onfour new antigens. Chin J Epidemiol, 2018, 39(4): 514–518 (in Chinese). 羅巧, 李霜君, 肖彤洋, 等. 結(jié)核分枝桿菌4種新抗原的克隆表達及血清學評價. 中華流行病學雜志, 2018, 39(4): 514–518.

[10] Burbelo PD, Keller J, Wagner J, et al. Serological diagnosis of pulmonaryinfection by LIPS using a multiple antigen mixture. BMC Microbiol, 2015, 15: 205.

[11] Infantes-Lorenzo JA, Whitehead CE, Moreno I, et al. Development and evaluation of a serological assay for the diagnosis of tuberculosis in alpacas and llamas. Front Vet Sci, 2018, 5: 189.

[12] Wang S, Wu J, Chen JZ, et al. Evaluation of-specific antibody responses for the discrimination of active and latent tuberculosis infection. Int J Infect Dis, 2018, 70: 1–9.

[13] Yan ZH, Yi L, Wei PJ, et al. Evaluation of panels ofantigens for serodiagnosis of tuberculosis. Int J Tubercul Lung Dis, 2018, 22(8): 959–965.

[14] Pukazhvanthen P, Anbarasu D, Basirudeen SA, et al. Assessing humoral immune response of 4 recombinant antigens for serodiagnosis of tuberculosis. Tuberculosis, 2014, 94(6): 622–633.

[15] Andersen P. The T cell response to secreted antigens of. Immunobiology, 1994, 191(4/5): 537–547.

[16] Sun L, Min CY, Qian Y, et al. Progress on PE/PPE proteins of mycobacterium tuberculosis. Chin J Zoon, 2013, 29(5): 499–503 (in Chinese). 孫林, 閔晨雨, 錢源, 等. 結(jié)核分枝桿菌PE/PPE蛋白研究進展. 中國人獸共患病學報, 2013, 29(5): 499–503.

[17] He XY, Zhuang YH, Zhang XG. The immunogenic characteristics of the recombinant 38 000 antigen from. Chin J Tubercul Respirat Dis, 2000, 23(8): 485–488 (in Chinese). 何秀云, 莊玉輝, 張曉剛. 結(jié)核分支桿菌重組38000蛋白的免疫原性特征. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2000, 23(8): 485–488.

[18] Dillon DC, Alderson MR, Day CH, et al. Molecular and immunological characterization ofCFP-10, an immunodiagnostic antigen missing inBCG. J Clin Microbiol, 2000, 38(9): 3285–3290.

[19] Chai XM, Li YL. The research progression of tuberculosis vaccine on antigen85 complex. Chin J Antitubercul, 2013, 35(4): 282–285 (in Chinese). 柴雪敏, 黎友倫. 結(jié)核分枝桿菌Ag85復合物相關疫苗研究進展. 中國防癆雜志, 2013, 35(4): 282–285.

[20] Huang YT, Lu XM, Yang XR, et al. Renaturation technology of recombinant fusion protein Trx-IFN-CSP. Biotechnol Bull, 2016, 32(6): 219–225 (in Chinese). 黃演婷, 盧雪梅, 楊小蓉, 等. 重組融合蛋白Trx-IFN-CSP復性工藝研究. 生物技術通報, 2016, 32(6): 219–225.

[21] Li SJ, Zhang ZG, Yu Q, et al. Application value of detectingspecific IgG/IgM antibodies for tuberculosis diagnosis with colloidal gold immunochromatography assay. Chin J Zoon, 2018, 34(2): 139–144 (in Chinese). 李霜君, 張治國, 余琴, 等. 膠體金免疫層析法檢測結(jié)核分枝桿菌特異性IgG/IgM抗體對結(jié)核病診斷的應用價值. 中國人獸共患病學報, 2018, 34(2): 139–144.

Preparation of multi-epitope recombinant diagnostic antigen of

Jian Gao1, 2, 3, and Ding Zhao1, 2, 3

1Department of Laboratory Medicine, Children’s Hospital Affiliated of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000,Henan,China 2Department of Laboratory Medicine, Zhengzhou Children’s Hospital, Zhengzhou 450000, Henan, China 3 Department of Laboratory Medicine, Henan Children’s Hospital, Zhengzhou 450000, Henan, China

Multi-epitope recombinant diagnostic antigen (designated ‘B102’) of(Mtb) was prepared and evaluated as a serological diagnostic antigen. With TRX at the N-terminal and His tag at the C-terminal, the multi-epitope Mtb recombinant diagnostic antigen including 11 predicted B-cell epitopes from 6 Mtb antigens (PstS1, ESAT6, CFP10, Ag85B, Ag85A and PPE54) was expressed inBL21 (DE3) and purified by Ni2+-Chelating affinity and DEAE anion exchange chromatography. Based on the antigenicity of B102 confirmed in Western blotting analysis, we constructed and evaluated a double-antigen sandwich ELISA for diagnosis of Mtb infection. The protein B102 exists in the form of inclusion bodies, accounting for 31.25% of the total proteins of the bacteria. After purification and renaturation, protein B102 exists in soluble form with the concentration 3.124 mg/mL and the homogeneity 96.71%. WB analysis demonstrated that protein B102 could react with antibodies in Mtb positive serum. Using the novel antigen in ELISA, we tested 60 Mtb-related positive and negative serum; The results showed the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values and coincidence rate of the detection method is 90.00%, 93.33%, 93.10%, 90.32% and 91.67%, respectively. The McNemer analysis suggested there was no statistical difference between the ‘Gold standard’ and the novel ELISA with kappa 0.833, which suggested the excellent consistency. By prokaryotic expression and chromatography purification, the multi-epitope recombinant antigen B102 was obtained with excellent antigenicity, which could be applied for Mtb-related serological detection.

multi-epitope recombinant diagnostic antigen,, prokaryotic expression, chromatography purification, serological diagnosis

10.13345/j.cjb.180392

September 21, 2018;

November 19, 2018

Ding Zhao. Tel/Fax: +86-371-85515776 ; E-mail: zhaoding_henan@126.com

2019-01-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190107.1101.001.html

(本文責編 郝麗芳)