毛竹莖稈伸長過程中赤霉素生物合成、降解和信號轉(zhuǎn)導關鍵基因的鑒定及表達分析

葉家其，張毓婷，傅鷹，周明兵, 2，湯定欽

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毛竹莖稈伸長過程中赤霉素生物合成、降解和信號轉(zhuǎn)導關鍵基因的鑒定及表達分析

葉家其1，張毓婷1，傅鷹1，周明兵1, 2，湯定欽1

1 浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300 2 浙江農(nóng)林大學 浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 311300

葉家其, 張毓婷, 傅鷹, 等. 毛竹莖稈伸長過程中赤霉素生物合成、降解和信號轉(zhuǎn)導關鍵基因的鑒定及表達分析. 生物工程學報, 2019, 35(4): 647–666.Ye JQ, Zhang YT, Fu Y, et al. Genome-wide identification and expression analysis of gibberellin biosynthesis, metabolism and signaling family genes in Phyllostachys edulis. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 647–666.

赤霉素 (Gibberellin) 是一類非常重要的植物激素，在高等植物生命活動的整個周期都起著重要的調(diào)控作用。從毛竹基因組中共鑒定出23個赤霉素途徑基因，包括赤霉素生物合成相關的8個和1個基因、降解相關的8個基因、參與赤霉素感知的2個基因以及信號轉(zhuǎn)導的2個基因和2個基因。擬南芥、水稻和毛竹的系統(tǒng)進化樹和保守基序分析顯示赤霉素的合成代謝與信號轉(zhuǎn)導在這些物種中是高度保守的。利用外源赤霉素處理毛竹種子和幼苗，發(fā)現(xiàn)赤霉素能顯著提高種子的萌發(fā)率和幼苗的莖稈伸長，并且有著最佳的作用濃度。在GA3處理后，毛竹體內(nèi)赤霉素生物合成基因和表達量均下調(diào)而降解活性赤霉素的基因表達量上調(diào)；赤霉素受體和正調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高而負調(diào)控基因的表達受到抑制。這些基因在竹筍莖稈的不同形態(tài)學位置表達差異明顯，大部分赤霉素生物合成與降解的相關基因、和以及赤霉素受體和正調(diào)控基因都在竹筍的形態(tài)學上端大量表達，而赤霉素信號轉(zhuǎn)導的阻遏基因在筍體形態(tài)學底端大量積累而頂端基本不表達。

毛竹，赤霉素，生物合成，代謝，信號轉(zhuǎn)導，基因表達

植物激素作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類痕量信號分子，對于調(diào)節(jié)植物的各種生長發(fā)育過程和環(huán)境應答具有非常重要的作用[1]。赤霉素(Gibberellin，GA)是調(diào)控植物體生長發(fā)育必不可缺的一類植物激素，最早發(fā)現(xiàn)于水稻的“惡苗病”，患病水稻體內(nèi)赤霉素過表達并且會出現(xiàn)瘋長的現(xiàn)象[2]。目前已經(jīng)鑒定的赤霉素有136種，按照它們被發(fā)現(xiàn)的順序依次命名為GA1、GA2、GA3、GA4等[3-4]，但其中只有GA1、GA3、GA4和GA7具有生物活性，其余均為GAs分子的代謝物和中間產(chǎn)物[5]。赤霉素在植物生長發(fā)育的各個階段都發(fā)揮著重要作用，它參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各種生理過程：如打破種子休眠并促進其萌發(fā)、植物生長、開花和果實發(fā)育等。其中最顯著的作用是促進節(jié)間的伸長，從而促進植物的生長[6-7]。赤霉素作用可以通過不同的途徑實現(xiàn)，主要包括赤霉素的合成代謝和極性運輸，以及赤霉素信號途徑，包括受體感知和信號轉(zhuǎn)導。

赤霉素的主要合成部位為植株的幼嫩組織，如根尖、莖尖以及生長中的果實和種子等[8]。在高等植物中，根據(jù)赤霉素合成途徑的亞細胞區(qū)域和該途徑中所參與的酶的種類，赤霉素的生物合成分為3個階段：1) 在質(zhì)體中，4個類異戊二烯形成一個C20的線性分子，牦牛兒牦牛兒焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGDP) 環(huán)化成赤霉素的前體——內(nèi)根-貝殼杉烯酸(Ent-kaurenoic acid)；2) 在質(zhì)體折疊區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，內(nèi)根-貝殼杉烯酸逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈谝环N形式的GA——GA12；3) 在細胞溶質(zhì)中，GA12先轉(zhuǎn)變?yōu)镃20-GA，然后轉(zhuǎn)變?yōu)镃19-GA，包括有活性的赤霉素。赤霉素的生物合成過程需要多種酶的參與，主要包括柯巴焦磷酸合酶(Ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase，KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase，KO)、GA20-氧化酶(GA20-oxidase，GA20ox)、GA3-氧化酶(GA3-oxidase，GA3ox) 和GA2-氧化酶(GA2-oxidase，GA2ox) 等[8-9]。盡管赤霉素代謝途徑早期代謝通量較大，但赤霉素后期的代謝酶(GA20ox、GA3ox、GA2ox) 對活性GA的精確調(diào)控具有關鍵作用[10]。活性赤霉素前體的合成過程都需要GA20ox的參與；GA20ox催化合成具有生物活性的赤霉素的倒數(shù)第二步，可以將GA12和GA53(C20類赤霉素) 轉(zhuǎn)化為GA9和GA20(C19類赤霉素)[11]。GA3ox是赤霉素合成途徑中最后一步的關鍵酶，進而將GA9和GA20催化合成為具有生物活性的GA1和GA4[12]。GA2ox是植物體內(nèi)赤霉素降解過程的關鍵酶，它可以將具有生物活性的GA1和GA4分別轉(zhuǎn)化為無活性的GA8和GA34，進而維持植物體內(nèi)具有生物活性的GAs與其中間產(chǎn)物之間的動態(tài)平衡[13]。GA20ox和GA3ox的缺少，會導致合成有生物活性赤霉素的量減少；而過表達的GA2ox則會降解植物體內(nèi)生物活性的赤霉素[14]。

植物體內(nèi)GAs平衡的調(diào)控過程，信號通路同樣發(fā)揮著重要的作用。赤霉素信號感知是植物體將細胞外赤霉素信號傳入細胞內(nèi)的過程。赤霉素GA信號可以被赤霉素受體GID1(Gibberellin insensitive dwarf1)感知到，當GID1感知到GA信號后，能夠激活信號通路，從而調(diào)控下游基因的表達，進而影響植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成。赤霉素信號轉(zhuǎn)導的基因路徑是GA-GID1-DELLA信號通路，組分包括赤霉素受體GID1、DELLA蛋白家族成員(DELLAs)以及與DELLA蛋白降解有關的帶有F-Box基序的同源蛋白[15]。GA的信號轉(zhuǎn)導是通過降解DELLA蛋白來實現(xiàn)的。當GA處于低水平時, GID1不與GA結合, 使DELLA蛋白與赤霉素應答基因結合并抑制其活性，進而阻遏植物的生長；當赤霉素處于高水平時，GID1可感知GA信號并與之結合形成GA-GID1，然后結合到DELLA蛋白中形成GID1-GA-DELLA復合三聚體[16]。當形成GA-GID1-DELLA 復合體時，F(xiàn)-Box蛋白中的泛素連接酶SCF能結合到DELLA蛋白的GRAS區(qū)域，通過泛素蛋白體通道迅速降解DELLA蛋白，導致其阻遏作用被解除，植物體表現(xiàn)出正常的赤霉素反應[15]。

近年來，在擬南芥[17]、水稻[18]、南瓜[19]、玉米[20]、大麥[21]、蘋果[22]、小桐子[10]等多種植物中，赤霉素合成、降解與信號轉(zhuǎn)導的基因家族已經(jīng)被大量鑒定和克隆。而對于多年生木本植物毛竹，這方面的研究還甚少。毛竹作為世界上最重要的非木材林產(chǎn)品之一，以其莖稈的快速拔節(jié)生長而備受關注[23]。目前毛竹高生長的機制尚未完全了解，許多研究者認為植物內(nèi)源激素，特別是生長素和赤霉素，在調(diào)節(jié)毛竹節(jié)間細胞伸長方面發(fā)揮著重要的作用[24]。在毛竹莖稈生長的過程中，赤霉素含量的動態(tài)變化與竹筍的快速生長有著密切的聯(lián)系，毛竹筍生長初期，GA3含量較低；而到了毛竹快速生長階段，GA3的含量急劇上升到了一個峰值[24]。因此，了解毛竹中赤霉素合成代謝途徑與信號轉(zhuǎn)導途徑關鍵基因可以從分子水平上更深刻地理解赤霉素與毛竹快速伸長的作用機制。同時，毛竹的基因組序列已經(jīng)被發(fā)布[25]，為進行赤霉素基因家族相關基因全面分析提供了一個絕佳的機會。本研究對赤霉素的合成代謝以及信號轉(zhuǎn)導相關基因進行鑒定，比較了毛竹與水稻和擬南芥在赤霉素合成代謝與信號轉(zhuǎn)導相關基因的進化關系；通過實時熒光定量PCR檢測了這些基因在外施赤霉素的毛竹實生苗和毛竹筍不同部位的表達特征，為深入探討赤霉素調(diào)控竹子生長發(fā)育的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毛竹赤霉素生物合成與代謝及信號轉(zhuǎn)導相關基因的數(shù)據(jù)獲取及進化分析

1.1.1 同源基因的數(shù)據(jù)獲取

從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(BambooGDB，http://www.bamboogdb.org/)下載毛竹的基因注釋和基因組序列。為了鑒定毛竹赤霉素途徑中涉及的基因家族，從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/)、擬南芥信息資源(TAIR，https://www. arabidopsis.org/)、水稻基因數(shù)據(jù)庫(RiceData，http://www.ricedata.cn/gene/) 和植物基因組數(shù)據(jù)庫(http: //www.phytozome. net/)中下載相應GAs合成代謝和信號轉(zhuǎn)導相關的氨基酸序列，作為BLAST軟件搜索毛竹數(shù)據(jù)庫的查詢序列，搜索毛竹基因組數(shù)據(jù)庫獲得第一循環(huán)的候選基因；同時具有e≤10–20的和score≥100的序列被用作第二循環(huán)搜索的新查詢以避免丟失額外的候選基因。利用Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/) 和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) 兩個在線網(wǎng)站中驗證這些候選基因，E值設定為

1.1.2 同源基因的進化分析和基序分布

將水稻和擬南芥中已經(jīng)鑒定的上述基因的蛋白序列與上述毛竹中最終確定的同源基因的蛋白序列利用ClustalX 1.81進行多重比對，參數(shù)設定為默認值，將生成的“aln.”文件導入MEGA 7.0[26]，并通過該軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)進化樹。采用以下參數(shù)：模式采用“Poisson model”，缺口設置“Complete deletion”，重復次數(shù)為Bootstrap=1 000次。利用MEME在線軟件(http：//meme-suite.org/) 進行蛋白保守基序的分析，E值設定為

1.2 毛竹種子與GA3處理

1.2.1 GA3處理種子的萌發(fā)率

試驗所使用的毛竹種子是半同胞，2017年采自廣西壯族自治區(qū)靈川縣大境鄉(xiāng)同一株開花毛竹，挑選大小一致的飽滿種子作為試驗材料。用70%酒精消毒種子表面60 s，滅菌水沖洗3遍；再用2% NaClO溶液浸泡10 min，滅菌水沖洗3遍，用不同濃度GA3(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)溶液浸種，滅菌水浸種作為對照。每組選擇100顆種子，黑暗浸泡24 h后用無菌水沖洗2–3次。置于滅菌的雙層濾紙上萌發(fā)，萌發(fā)環(huán)境25 ℃并全程黑暗處理。每天檢查并記錄種子萌發(fā)數(shù)量，2周后統(tǒng)計種子發(fā)芽率，并進行差異顯著性分析。

1.2.2 幼苗生長實驗

為了確定GA3濃度對毛竹生長的影響，將毛竹種子在0、50、100、200 mg/L的赤霉素溶液中浸泡24 h并黑暗萌發(fā)2周后，每組選擇萌發(fā)狀態(tài)良好且一致的幼芽20顆，轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光周期為光照16 h、黑暗 8 h。4周后測量幼苗的根、莖、葉長度并進行差異顯著性分析。根長為伸直的主根長度，莖長為根部以上到最近的第一片伸展葉片之間的距離，葉長為第二片伸展葉片的長度。

1.2.3 毛竹中赤霉素作用相關的基因?qū)A3的響應

在25 ℃培養(yǎng)室中16 h光照/8 h黑暗處理的條件下，在土壤中培育毛竹幼苗4周。用不同濃度的GA3(0、50、100、200 mg/L) 噴施葉片，以2 d的間隔噴施2周，在最后一次噴施后立即剪取毛竹幼苗的莖和葉組織用于下一步的RT-PCR分析；對于時間梯度的試驗，4周齡幼苗用100 mg/L赤霉素噴施葉片，在不同的時間點(1、3、6、12、24 h)剪取毛竹幼苗的莖和葉組織，以4周齡噴施清水的毛竹幼苗作為對照[27]。試驗的所有材料均采用3次生物學重復，剪取的幼苗葉片立即置于液氮速凍，?80 ℃保存。

采用Trizol (TaKaRa公司) 法提取毛竹幼苗的莖和葉組織的總RNA，用Prime ScriptTMRT Master Mix (TaKaRa公司) 去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物的設計選擇在每個基因非保守區(qū)域，擴增片段均為150 bp左右，PCR檢測引物特異性(表1)。反應體系(10 μL)：5 μL SYBR?Premix ExTMII (TaKaRa公司)，0.8 μL cDNA，0.4 μL primer-F，0.4 μL primer-R，3.4 μL 無菌水。反應條件為：95 ℃，7 min；預擴增95 ℃10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。選取NTB為內(nèi)參基因[28]，以噴施清水的材料作為對照組設定為1，處理樣品中每個基因的表達水平均以此為參照，以3次生物學重復結果用2-△△Ct的方法計算相對表達量[29]，并進行差異顯著性分析。

1.3 毛竹不同節(jié)間中赤霉素相關基因的表達分析

試驗所采集的毛竹筍均來自于浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室的翠竹園中，選取當年正處莖稈快速伸長的地徑接近且株高150 cm左右的毛竹筍3株作為材料重復，以地面附近沒有根的第一節(jié)定義為竹筍的第1節(jié)。每株筍按形態(tài)學位置自下而上分別取材第7節(jié)、第15節(jié)、第27節(jié)作為毛竹基部、中部和頂部的代表節(jié)間。RNA的提取和RT-PCR同1.2.3。采用均一化法比較每個基因在毛竹筍不同部位的表達量差異。將每個基因的表達量進行Z-score處理[30]，使得每一個基因在所有樣本的表達量都變成了均值為0、標準差為1的一組值。通過在線網(wǎng)站http://www. omicshare.com/tools/繪制表達量熱圖。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 毛竹基因組中赤霉素作用關鍵基因家族的鑒定

為了揭示赤霉素影響毛竹莖稈生長的作用，本研究搜索了毛竹全基因組，鑒定毛竹中的赤霉素關鍵基因。利用已知的擬南芥中26個GAs相關基因和水稻中12個GAs相關基因作為模板，經(jīng)過Blastp檢索，基于E值設定

2.1.1 赤霉素的生物合成基因

GA20ox和GA3ox家族基因調(diào)控赤霉素生物合成，對植物細胞中的赤霉素積累起著關鍵作用。它們都是由小基因家族編碼，在不同的物種中有著各自的保守基序。圖1為GA20ox蛋白家族在擬南芥、水稻和毛竹的進化樹，顯示各個基因在這3個物種中都比較保守，而毛竹與同為禾本科的水稻親緣關系更為接近。其中PhGA20ox4、PhGA20ox6、PhGA20ox7、PhGA20ox8這4個蛋白序列的保守性比較低，并且MEME的基序搜索結果顯示這4個基因的序列長度更短并且有保守基序的缺少現(xiàn)象。Motif 1、Motif 2和Motif 9在各個物種中高度保守，其中包含了與GA底物結合有關的LPWKET基序、H和D殘基等(圖1，表3)。

表2 赤霉素相關基因的鑒定及命名

GA3ox催化合成具有生物活性的GA1和GA4，是活性赤霉素合成途徑的關鍵一步。進化關系顯示GA3ox在不同的物種中高度保守，毛竹的蛋白序列與擬南芥和水稻的同源蛋白的相似度分別達到了76.77%和81.92%，并且它們都具有共同的保守基序(圖2，表4)。

圖1 GA20ox家族系統(tǒng)進化樹和保守基序分析

表3 GA20ox保守基序注釋

2.1.2 赤霉素的降解基因

調(diào)控GA降解的關鍵基因家族GA2ox在擬南芥、水稻和毛竹中的保守性較差，但共同含有幾個重要的保守基序，如Motif 1和Motif 6存在于所有的基因中(圖3，表5)。擬南芥GA2ox家族的基因普遍存在著Motif 10缺少現(xiàn)象，而水稻的基因家族缺少了Motif 9；同樣在毛竹的PhGA2ox5、PhGA2ox7、PhGA2ox8蛋白存在著許多片段的丟失，表明該組基因在不同的物種中可能存在著部分功能的異化。

圖2 GA3ox家族系統(tǒng)進化樹和保守基序分析

表4 GA3ox保守基序注釋

圖3 GA2ox家族系統(tǒng)進化樹和保守基序分析

表5 GA2ox保守基序注釋

GA20ox、GA3ox、GA2ox這3類赤霉素氧化酶都屬于2OG-Fe (Ⅱ) oxygenase亞家族，蛋白序列都含有2OG-Fe保守結構域。研究赤霉素氧化酶基因家族在擬南芥、水稻和毛竹這3個物種中的進化屬性發(fā)現(xiàn)，功能不同的GA20ox、GA3ox、GA2ox聚類分布在不同的亞家族中(圖4)。在3個物種中，GA20ox和GA2ox的基因數(shù)目均多于GA3ox，表明GA20ox和GA2ox經(jīng)歷了動態(tài)進化路線，導致更多功能的冗余。

2.1.3 赤霉素的信號轉(zhuǎn)導基因

赤霉素信號通路的發(fā)現(xiàn)來源于對水稻赤霉素受體OsGID1的研究；相對于水稻，擬南芥中含有3種GID1的同源類似蛋白，分別是AtGID1A、AtGID1B和AtGID1C。通過蛋白序列同源比對，在毛竹基因組文庫種找到2個GID1成員，命名為PhGID1A和PhGID1B，與水稻同源蛋白的相似性分別為89.34%和80.87%。系統(tǒng)進化樹與保守基序的分析均顯示GID1在不同的物種中高度保守(圖5，表6)。

在毛竹基因組文庫中找到了2個DELLA的成員，命名為PhSLR1和PhGAI。構建的系統(tǒng)演化樹(圖6) 顯示毛竹的DELLA類基因與水稻更加近緣；并且在毛竹的2個DELLA蛋白都存在著保守序列的缺少現(xiàn)象，其中PhSLR1蛋白中缺少了Motif 1、5、8、10；而PhGAI蛋白中缺少了Motif 4、6、7、10，可能它們上功能上出現(xiàn)了異化和互補(表7)。

F-Box蛋白在毛竹基因組文庫中有了2個F-Box的成員，命名為PhGID2A和PhGID2B，其中PhGID2A與水稻同源性更高而PhGID2B與擬南芥更加近緣。F-Box家族蛋白序列長度短且保守基序數(shù)目少，但是在不同的物種中具有著高度的保守性(圖7，表8)。

2.2 毛竹幼苗對外源GA3的響應

2.2.1 生長參數(shù)統(tǒng)計

將記錄的種子萌發(fā)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，分別計算不同濃度處理后的種子萌發(fā)率，結果顯示GA3處理顯著提高了毛竹種子的萌發(fā)率(圖8A)。100 mg/L處理組的萌發(fā)率最高，達到了67%，50 mg/L處理組和200 mg/L處理組的萌發(fā)率分別是59%和54%，均高于對照組的43%，說明在一定范圍內(nèi)不同濃度的赤霉素浸泡毛竹種子均能提高其種子萌發(fā)率且種子萌發(fā)的最佳赤霉素濃度在100 mg/L左右。200 mg/L處理組的萌發(fā)率雖高于對照組但已呈現(xiàn)下降趨勢，說明過高濃度的赤霉素反而會造成生長逆境，抑制種子的萌發(fā)。

圖4 GA2ox、GA3ox和GA20ox的系統(tǒng)進化樹

同時，用不同濃度的GA3浸泡毛竹種子，萌發(fā)后的毛竹幼苗的根莖葉長度都有所增加(圖8B–D。莖長和葉長增加效果顯著，3個處理組的主莖長度分別提高了44.0%、55.1%、50.1%；主葉長度分別提高了41.4%、62.9%、55.9%。赤霉素濃度在100 mg/L時莖與葉達到最佳的生長效果，200 mg/L赤霉素處理雖然促進效果仍顯著，但是相比 100 mg/L已經(jīng)有了一定程度的抑制。而根系的增長效果不明顯，3個處理組僅分別增加了1.8%、4.8%、5.4%。表明外源赤霉素可以有效刺激毛竹的營養(yǎng)生長，明顯促進了莖和葉的生長，但對根的生長基本無促進作用。另外，赤霉素處理的毛竹幼苗，“瘋長”現(xiàn)象僅體現(xiàn)在垂直方向上的高度，莖稈細長沒有粗度上的增加，并且大量出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象。

2.2.2 外源GA3處理下赤霉素作用相關基因的表達變化

通過qRT-PCR檢測不同濃度(0、50、100、200 mg/L) 赤霉素GA3處理下、、、、和的相對表達量 (圖9)。

圖5 GID1家族系統(tǒng)進化樹和保守基序分析

表6 GID1保守基序注釋

圖6 DELLA家族系統(tǒng)進化樹和保守基序分析

應用外源性赤霉素GA3處理后，的表達量顯著下調(diào)，且外源赤霉素濃度越高其表達水平越低。相一致的是，參與赤霉素生物合成的基因在各個濃度處理組中也都顯示下調(diào)。而在GA3處理后的幼苗中表達量升高，并且在高濃度處理組的表達量更高。至于信號轉(zhuǎn)導的相關基因，的相對表達量受到了GA3嚴格的負反饋，各個濃度的處理組與對照組相比全部下調(diào)表達；而GA3處理卻使表現(xiàn)為極顯著的上調(diào)表達，200 mg/L處理組的表達量達到了對照組的2.7倍。赤霉素受體對外源GA3的濃度變化不敏感，在各個處理組的表達量都略高于對照組。

表7 DELLA保守基序注釋

圖7 F-Box家族系統(tǒng)進化樹和保守基序分析

表8 F-Box保守基序注釋

對4周齡毛竹幼苗噴施100 mg/L GA3，通過qRT-PCR檢測其在處理后不同時期(0、1、3、6、12、24 h)、、、、和的相對表達量(圖10)。結果顯示這些基因在GA3處理后的24 h內(nèi)表達量都發(fā)現(xiàn)了顯著的變化。赤霉素生物合成相關基因和整體呈表達量下調(diào)趨勢。其中在處理后3 h表達量達到最低，僅為對照的43.8%，之后開始升高但仍低于未處理組，處理后24 h的表達量為未處理時的80.1%；而對GA3的響應有一個更為復雜的過程，其表達量也是在3 h時達到最低，只有對照組的32.9%，而6 h時恢復到了未處理時的表達水平，隨后在12 h和24 h又出現(xiàn)了明顯的降低和升高，最終在24 h時的表達量開始相比未處理時提高了38.9%。赤霉素代謝基因在GA3處理后表達量開始顯著上調(diào)，1 h時的表達量比對照提高了67.0%，隨后開始持續(xù)下降，12 h后的表達量下降到了未處理時的水平，24 h后表達量為對照的111.5%。赤霉素受體基因在外源赤霉素處理過程中變化相對溫和，在最初的1 h和3 h，表達量比對照下降了18.2%和30.8%，6 h時的表達量升高到了未處理時的111.6%，12 h開始略微下降，24 h時又逐漸升高到了未處理時的125.7%。在處理后的各個時間段均表達上調(diào)，1 h時表達量上調(diào)10.9%，3 h時已急劇上升為對照的237.8%，達到最高，隨后逐漸下降但所有處理時間段表達量均高于未處理組，24 h表達量降至對照的121.6%。類基因表達量隨時間不斷呈現(xiàn)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)的趨勢，然而在每個時間段的表達量均未高于對照組，最低的表達量出現(xiàn)在6 h，為對照組的45.4%。

2.3 毛竹筍不同節(jié)間的表達分析

赤霉素關鍵基因在1.5 m高毛竹筍3個節(jié)間均檢測到表達，并且各個基因的表達趨勢在3株重復中具有較好的一致性，推測這些基因在毛 竹快速生長的過程都發(fā)揮著一定的作用(圖11)。赤霉素生物合成相關的基因家族和在毛竹筍的不同部位都高表達，尤其是在頂部和中部；而調(diào)控赤霉素失活的基因家族也在毛竹筍的形態(tài)學上端高表達。赤霉素受體表達主要集中在頂部和中部，基部基本上沒有檢測到表達。在3個部位也都有表達，其中頂部的表達量最高，基部表達量最低，但不同部位的表達差異不是很明顯；而相關基因在根部的表達量顯著高于頂部及中部?？梢钥闯?，與的表達具有一致性，而與的表達趨勢相反。

圖8 GA3處理對毛竹種子萌發(fā)率和幼苗生長的影響

圖9 不同濃度GA3處理4周齡毛竹幼苗后的基因表達水平分析

3 討論

毛竹是我國分布面積最廣且經(jīng)濟價值最高的竹種，毛竹筍的生長速度很快，高生長時期每天凈高度增長量高達50 cm以上，這種快速生長的機理具有重要的學術研究價值。前人的大量研究發(fā)現(xiàn)，毛竹的高生長過程伴隨著赤霉素等植物激素含量的急劇增加[24, 31]，因此推測赤霉素在毛竹的快速生長中發(fā)揮著重要的作用。在竹筍快速生長過程中，對赤霉素動態(tài)變化及其關鍵基因表達量變化的研究有助于我們了解毛竹莖稈快速伸長的機制。

圖10 GA3處理后不同時間段的基因表達水平分析

通過生物信息學分析，從毛竹基因組中共鑒定出了17個赤霉素合成代謝基因和6個信號轉(zhuǎn)導的相關基因。相比于擬南芥、水稻、玉米等植物，毛竹基因組更為龐大，但是參與赤霉素生物合成和信號轉(zhuǎn)導的基因成員數(shù)量卻較少，尤其是GA3氧化酶家族，僅檢索到了1位成員。這可能是由于本次研究刪去了大量序列相似性較低的同源基因以及冗余基因，并且當前的毛竹基因組存在著個別序列的注釋信息不完全和CDS缺失等組裝問題。另一種假設是由于物種分化后，草本植物中竹子在蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(COGs)的構建和擴增中種類數(shù)量最多[25]，因此導致毛竹中的基因家族比其他物種更加分散和極化。擬南芥、水稻和毛竹的赤霉素相關基因的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示赤霉素的合成代謝與信號傳導途徑基因在這些物種中是高度保守的。而毛竹的大多數(shù)基因與水稻的同源基因相似性更高，可能毛竹與水稻的赤霉素關鍵基因在進化關系上有著共同的祖先[32]，而序列的高保守性預示著功能的保守性。

圖11 赤霉素關鍵基因在毛竹筍不同部位的表達分析

赤霉素參與調(diào)控植物生理發(fā)育的各個過程，包括種子萌發(fā)、根的生長、莖的伸長和葉片伸展等。王巍等[33]用不同濃度的GA3處理核桃種子，發(fā)現(xiàn)300 mg/L的GA3處理組發(fā)芽率最高達到了87.2%。高春智等[34]在樟子松上的研究也表明，噴施GA3能顯著提高樟子松種子的發(fā)芽率。毛竹自然結實率低且種子采集困難，室溫貯藏還會使種子喪失發(fā)芽能力，這些都在一定程度上限制了毛竹實生苗的培育工作。本研究用不同濃度的GA3處理毛竹種子的實驗也同樣表明，用不同濃度的GA3浸種后促進了毛竹種子的萌發(fā)并且 100 mg/L GA3的促進效果最顯著，并且有著最佳的濃度范圍。吳建明等[35]研究發(fā)現(xiàn)赤霉素處理可以誘導甘蔗節(jié)間伸長，增加株高；楊益善等[36]在水稻上的研究也發(fā)現(xiàn)，赤霉素可以促進水稻莖的伸長。我們同時比較了不同濃度GA3浸種處理對毛竹幼苗根、莖、葉生長的影響，結果與GA3對發(fā)芽的效應一致，赤霉素處理后的毛竹莖和葉的伸長促進效果明顯，并且最適濃度在100 mg/L左右，而對根的影響效果不明顯?？傊嗝顾靥幚韺γ穹N子的萌發(fā)與幼苗的生長均有明顯的促進作用。

參與毛竹生物合成的相關基因?qū)τ谕庠碐A3的響應有著協(xié)調(diào)一致性，外施GA3使毛竹幼苗內(nèi)的赤霉素生物合成基因和表達量明顯下調(diào)，并且濃度越高對基因表達的抑制作用越明顯；相反，催化植物中活性GAs滅活的基因在高濃度的處理組表達量更高。同時對GA3處理后的5個時期的表達量進行測定，發(fā)現(xiàn)表達量先下調(diào)后上調(diào)，整體表現(xiàn)下調(diào)趨勢，而的表達量整體呈上調(diào)趨勢。這與前人關于赤霉素處理植物的結論相同，Carrera等[37]研究表明，馬鈴薯的gal矮化突變體具有較高的GA-20氧化酶轉(zhuǎn)錄水平，外施GA3后，3種GA-20氧化酶 (StGA20ox1、StGA20ox2和StGA20ox3) 在馬鈴薯gal突變體內(nèi)表達明顯減少；董鳳等[22]對蘋果的研究也發(fā)現(xiàn)外施赤霉素會使表達量減少而表達增高。與的表達趨勢不同，的表達量在處理后的某段時期還出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象，可能是因為作為赤霉素生物合成的最后一步，在赤霉素含量驟然升高或降低時，起著更重要的反調(diào)節(jié)作用，從而維持植物體內(nèi)赤霉素的平衡[38]。并且，在外界GA3的刺激下，大量赤霉素受體基因與赤霉素相結合，導致赤霉素受體基因的表達量升高，結果與李俊等[39]東方山羊豆在GA3處理下的基因表達水平相一致?？傊斖馐〨A3時，一方面毛竹幼苗通過抑制體內(nèi)赤霉素合成反應并加強體內(nèi)活性赤霉素滅活基因的表達，來實現(xiàn)植物體內(nèi)GA水平的穩(wěn)態(tài)平衡；另一方面，赤霉素受體基因及正調(diào)控因子基因的表達水平顯著提高，解除了DELLA蛋白的積累對毛 竹生長的阻遏作用，植株表現(xiàn)出正常的赤霉素 反應。

本研究選取了快速生長時期毛竹筍的基部、中部和頂部節(jié)間進行qRT-PCR分析，通過組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，在毛竹筍快速生長階段的3個節(jié)間，赤霉素合成代謝與信號轉(zhuǎn)導途徑關鍵酶基因的表達量均發(fā)生了一定變化。生物合成相關基因家族和在毛竹筍的形態(tài)學上部都過量表達，為頂端節(jié)間的伸長提供了充足的內(nèi)源激素；而調(diào)控赤霉素代謝的基因家族在中部和頂部也高表達，毛竹筍幼嫩部位的生命活動最旺盛，大量合成赤霉素，的高表達能夠?qū)⑦^量合成的赤霉素進行降解[13]。丁興萃[31]曾分析了毛竹筍各部位的內(nèi)源激素含量及動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在竹筍生長初期，赤霉素在筍尖合成，通過極性運輸?shù)街胁?，一般赤霉素在各個部位的含量為頂部>中部>基部。而本研究從合成代謝關鍵基因進行分析，發(fā)現(xiàn)基因表達模式和赤霉素體內(nèi)含量分布一致。信號轉(zhuǎn)導途徑的基因和在筍的各個部位也都有表達，并且在筍頂部和中部表達要明顯高于基部。而DELLA類蛋白相關基因表達趨勢相反，在毛竹筍形態(tài)學上部的中部和頂部表達量非常低甚至沒有檢測到表達。這三類基因已在其他物種中廣泛報道，的大量表達抑制植物的生長伸長，是赤霉素的負調(diào)控基因；GID1是赤霉素的受體，能夠感知赤霉素信號并介導DELLA類蛋白的泛素化降解；GID2是降解DELLA蛋白的泛素酶體復合物的主要成分，DELLA的降解使赤霉素得以大量表達并誘導植物快速生長[15, 40]。毛竹筍中赤霉素信號轉(zhuǎn)導途徑相關基因的表達模式與其生物學功能也是相吻合的：毛竹筍進入快速生長階段，筍尖大量合成赤霉素，PhGID1大量表達并接收赤霉素信號，然后與DELLA蛋白形成GID1-GA-DELLA復合體，阻止赤霉素信號的傳遞；此時大量表達的將DELLA蛋白泛素化標記并介導其降解，DELLA的阻遏作用解除，赤霉素大量表達，筍開始快速生長。

4 結論

本研究對赤霉素生物合成與信號轉(zhuǎn)導途徑的相關基因家族在毛竹中的同源基因進行了系統(tǒng)的鑒定，找到了6個多基因家族編碼的蛋白，包括參與赤霉素合成代謝的GA20ox、GA3ox和GA2ox以及信號轉(zhuǎn)導途徑的GID1、GID2和DELLA蛋白。并初步探索了外源赤霉素處理對毛竹種子萌發(fā)的影響，證明了赤霉素在毛竹中也有著促進種子萌發(fā)和促進莖稈伸長等作用，且有最佳的濃度范圍；同時，外施赤霉素會引起毛竹體內(nèi)赤霉素相關基因表達模式變化，植物體通過反饋調(diào)節(jié)的方式控制體內(nèi)活性GA的平衡。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了大量的赤霉素類基因參與到毛竹的快速生長這一復雜的生理過程中，并且基因的表達模式與毛竹體內(nèi)的赤霉素含量分布一致，也與其生物學功能一致，為深入探討赤霉素調(diào)控竹子生長發(fā)育的機制奠定了基礎。但是，本研究尚未進行基因克隆等方面的分析，在后續(xù)的試驗中應當重點關注。

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Genome-wide identification and expression analysis of gibberellin biosynthesis, metabolism and signaling family genes in

Jiaqi Ye1, Yuting Zhang1, Ying Fu1, Mingbing Zhou1, 2, and Dingqin Tang1

1 State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China 2 Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center for Bamboo Resources and High-Efficiency Utilization, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

Gibberellin is an essential plant hormone that plays an important regulatory role throughout the life cycle of higher plants. A total of 23 genes involved in gibberellin action were identified fromgenome, including 8and 1genes involved in the gibberellin biosynthesis, 8genes involved in the metabolism of gibberellin, 2genes involved in gibberellin perception, 2genes and 2genes involved in gibberellin signal transduction. Phylogenetic analysis of these genes from,andrevealed that gibberellin biosynthesis, metabolism, and signaling pathways are conserved in these species. Treatment of seeds and seedlings of bamboo with exogenous gibberellin revealed that gibberellin significantly increased seed germination rate and stem elongation of seedlings, and had the best concentration of action. The expression levels ofandgenes in the bamboo seedlings were down-regulated and the expression of the active gibberellin-degrading genewas up-regulated after GA3treatment, and the transcriptional level of the gibberellin receptorand the positive regulatory genewas significantly increased while the expression of the negative regulatory genewas decreased. These genes have significant differences in the expression of different spatial locations of bamboo shoot stems,,,,andare all expressed in the upper part of bamboo shoots, while the repressor geneaccumulates at the bottom of the shoots and is hardly expressed at the top.

, gibberellin, biosynthesis, metabolism, signal transduction, gene expression

10.13345/j.cjb.180424

October 15, 2018;

January 14, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31500542, 31870656, 31470615), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. 2016C02056-8).

Mingbing Zhou. Tel: +86-571-63743869; E-mail: zhoumingbing@zafu.edu.cn

Dingqin Tang. Tel: +86-571-63748811; E-mail: tang@zafu.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 31500542，31870656，31470615)，浙江自然科學基金 (No. 2016C02056-8) 資助。

2019-02-14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190212.1446.001.html

(本文責編 郝麗芳)