利用扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵生產(chǎn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的條件及其抗氧化活性

侯若琳，李琳，項(xiàng)凱凱，吳小平，林文雄，鄭明鋒，傅俊生

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利用扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵生產(chǎn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的條件及其抗氧化活性

侯若琳1，李琳2，項(xiàng)凱凱2，吳小平3，林文雄2，鄭明鋒1，傅俊生2

1 福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002 2 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002 3 福建農(nóng)林大學(xué) 菌物研究中心，福建 福州 350002

侯若琳, 李琳, 項(xiàng)凱凱, 等. 利用扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵生產(chǎn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的條件及其抗氧化活性. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 667–676.Hou RL, Li L, Xiang KK, et al. Production of antioxidative exopolysaccharides of Cordyceps militaris with Vernonia amygdalina leaves in substrate. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 667–676.

蛹蟲(chóng)草胞外多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞等藥理活性，有極高的保健價(jià)值。為高效地獲取蛹蟲(chóng)草胞外多糖，本研究通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的扁桃斑鳩菊葉粉末，來(lái)提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量，并對(duì)優(yōu)化得到的胞外多糖紅外吸收光譜和化學(xué)抗氧化活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，液體發(fā)酵最優(yōu)條件為：扁桃斑鳩菊葉粉末添加量8 g/L、發(fā)酵時(shí)間9 d、pH 6.5、接種量5.0 mL，在此條件下，蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)量可達(dá)(5.24±0.28) mg/mL，與未添加扁桃斑鳩菊葉的空白組相比，胞外多糖產(chǎn)量提高了約205.20%；紅外分析與抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扁桃斑鳩菊葉對(duì)蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)的胞外多糖結(jié)構(gòu)和活性影響較小。該研究結(jié)果表明扁桃斑鳩菊葉能夠有效地提高蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)量，為蛹蟲(chóng)草胞外多糖的高效生產(chǎn)提供了新思路。

蛹蟲(chóng)草，扁桃斑鳩菊葉，胞外多糖，抗氧化

蛹蟲(chóng)草(L.Link)，又名北冬蟲(chóng)夏草，屬于子囊菌亞門(mén)核菌綱球殼目麥角菌科蟲(chóng)草屬[1]。多糖是蛹蟲(chóng)草主要活性物質(zhì)[2]，已有大量研究證實(shí)，蛹蟲(chóng)草多糖有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等功效[3-4]，因而其具有非常巨大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。蛹蟲(chóng)草目前已實(shí)現(xiàn)了人工栽培[5]，這為蛹蟲(chóng)草多糖的大量獲取提供了基礎(chǔ)，但是人工栽培蛹蟲(chóng)草子實(shí)體周期較長(zhǎng)，這在一定程度上限制了蛹蟲(chóng)草多糖的高效生產(chǎn)。胞外多糖是一種通過(guò)液體發(fā)酵技術(shù)快速獲得的菌株活性代謝產(chǎn)物，能夠在一定程度上表現(xiàn)出與子實(shí)體多糖相近的活性，其與從子實(shí)體中獲取多糖的途徑相比具有更短的生產(chǎn)周期，并且避免了多糖繁瑣的熱水提取過(guò)程。

胞外多糖的產(chǎn)量和活性通常會(huì)受發(fā)酵條件影響，如何高效地發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖就顯得尤為重要。已有許多研究表明，通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)闹兴幉奈镔|(zhì)可以提高菌株活性代謝物質(zhì)的產(chǎn)量，2011年，賀宗毅等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加適量的天麻到發(fā)酵培養(yǎng)基中，可以顯著地提高灰樹(shù)花胞外多糖的產(chǎn)量；2015年，徐丹丹[7]探究了鐵皮石斛原球莖對(duì)羊肚菌發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛原球莖能夠促進(jìn)羊肚菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖。目前，有關(guān)蛹蟲(chóng)草胞外多糖發(fā)酵優(yōu)化的研究主要是通過(guò)調(diào)整發(fā)酵所需的氮源、碳源及微量元素來(lái)達(dá)到提高胞外多糖產(chǎn)量的目的[8-10]，而其胞外多糖的產(chǎn)量提升能否通過(guò)添加藥性基質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，目前還尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

扁桃斑鳩菊葉是菊科斑鳩菊屬植物扁桃斑鳩菊(Del.) 的葉，又稱南非葉，是一種重要的中藥材[11-12]。扁桃斑鳩菊葉主要活性成分有皂苷、生物堿、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等，具有抗氧化、保肝、抗癌、降血脂等作用[13]。實(shí)驗(yàn)前期經(jīng)過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)扁桃斑鳩菊葉能夠有效地提高蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)量。為進(jìn)一步明確添加扁桃斑鳩菊葉促進(jìn)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的適宜條件，本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)液體發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化發(fā)酵得到的胞外多糖進(jìn)行了紅外光譜和抗氧化活性分析，以期為蛹蟲(chóng)草胞外多糖的高效生產(chǎn)及其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

蛹蟲(chóng)草菌種：實(shí)驗(yàn)室收藏菌種(菌株編號(hào)：MF28，ITS序列NCBI登錄號(hào)：MF379054)；扁桃斑鳩菊葉(實(shí)驗(yàn)室種植獲得)。

1.1.2 試劑和儀器

葡萄糖、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；二苯基苦味?；诫?DPPH，Sigma公司)；純電熱鼓風(fēng)干燥箱(SYIOIS-2型，天津市三水科學(xué)儀器有限公司)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；恒溫?fù)u床THZ-98AB (上海一恒科技儀器有限公司)；pH計(jì)(FE-20型，梅特勒托利多儀器有限公司)；紅外光譜儀(德國(guó)布魯克儀器公司)。

1.2 發(fā)酵液胞外多糖含量的測(cè)定

1.2.1 發(fā)酵液收集

將發(fā)酵液10 000 r/min離心3 min，收集上清液，備用。

1.2.2 胞外多糖含量的計(jì)算

參照陳才法等[14]的研究方法計(jì)算發(fā)酵液胞外多糖含量，即胞外多糖含量=總糖含量?還原糖含量。

1.2.3 總糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法[15]測(cè)定發(fā)酵液中總糖含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品測(cè)定的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 (=4.436 1+ 0.062 1，2=0.999 1)，計(jì)算得到發(fā)酵液總糖含量。

1.2.4 還原糖含量的測(cè)定

采用DNS法[16]測(cè)定發(fā)酵液中還原糖含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品測(cè)定的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(=0.751 3+ 0.040 4，2=0.996 5)，計(jì)算得到發(fā)酵液還原糖含量。

1.3 扁桃斑鳩菊葉粉末及其發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備

將采摘后的新鮮扁桃斑鳩菊葉置于烘箱50 ℃烘干，然后用粉碎機(jī)將干燥的扁桃斑鳩菊葉粉碎，過(guò)80目篩，備用。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為加富的PDB培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B110 mg，沸水煮沸30 min，3層紗布過(guò)濾，加水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.4 蛹蟲(chóng)草液體菌種制備

將蛹蟲(chóng)草菌株活化后，接入裝有100 mL PDB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于25 ℃、 160 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d。接種前，將菌種用無(wú)菌水稀釋1倍，備用。

1.5 液體發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.1 扁桃斑鳩菊葉粉末添加量

在單因素實(shí)驗(yàn)中，保持所探究變量以外的其他條件相一致，并在前一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探究下一個(gè)因素的適宜條件。在裝有90 mL PDB加富培養(yǎng)基的搖瓶中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g扁桃斑鳩菊葉粉末，每組重復(fù)3次，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，每個(gè)搖瓶中接入10 mL蛹蟲(chóng)草液體菌種，放入搖床，于25 ℃、160 r/min避光培養(yǎng)7 d，收集發(fā)酵液測(cè)定多糖含量。

1.5.2 發(fā)酵時(shí)間

取適量的扁桃斑鳩菊葉粉末加入裝有90 mL PDB加富培養(yǎng)基的搖瓶中，每組重復(fù)3次，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，每個(gè)搖瓶中接入10 mL蛹蟲(chóng)草菌種，放入搖床，于25 ℃、160 r/min避光培養(yǎng)，分別培養(yǎng)4、5、6、7、8、9 d，收集發(fā)酵液測(cè)定多糖含量。

1.5.3 pH

取適量的扁桃斑鳩菊葉粉末添加到有90 mL PDB加富培養(yǎng)基的搖瓶中，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，每組重復(fù)3次，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，各搖瓶均接入10 mL蛹蟲(chóng)草菌種，放入搖床，于25 ℃、160 r/min避光培養(yǎng)8 d，收集發(fā)酵液測(cè)定多糖含量。

1.5.4 接種量

取適量的扁桃斑鳩菊葉粉末加入到裝有PDB加富培養(yǎng)基的搖瓶中，將pH調(diào)至適宜，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，各組接入2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL蛹蟲(chóng)草菌種，每組重復(fù)3次，放入搖床，于25 ℃、160 r/min避光培養(yǎng)8 d，收集發(fā)酵液測(cè)定多糖含量。

1.6 液體發(fā)酵正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)扁桃斑鳩菊葉粉末添加量、發(fā)酵時(shí)間、pH和接種量進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，以胞外多糖含量為考察指標(biāo)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 蛹蟲(chóng)草胞外多糖發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素及水平

1.7 胞外多糖紅外光譜分析

1.7.1 胞外多糖制備

參照張建國(guó)等[17]的方法，發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾除去菌絲體，將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，用蒸餾水復(fù)溶，采用Sevage法除去蛋白雜質(zhì)，離心收集上清液，將多糖溶液裝入透析袋中流水透析48 h，除去小分子物質(zhì)，將透析后的多糖溶液凍干，得到精制的胞外多糖。

1.7.2 紅外分析

參照韓麗榮等[18]的方法，將精制的胞外多糖粉末與KBr 研磨混勻壓片，然后在紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)定，采用2 /cm的分辨率，掃描60次，掃描范圍為400–4 000 /cm。

1.8 胞外多糖抗氧化活性分析

1.8.1 ABTS自由基清除率的測(cè)定

參照孫曉琦等[19]的研究方法。取1.5 mL的ABTS工作液和100 μL不同質(zhì)量濃度(0.25、0.5、1、2、4 mg/mL) 的樣品溶液，加入試管混勻，室溫下避光反應(yīng)1 h，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值X；以蒸餾水替代樣品溶液測(cè)定吸光值0；以蒸餾水替代ABTS測(cè)定吸光值X0。根據(jù)公式(2)計(jì)算清除率，實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，取平均值。

清除率(%)=[1?(X?X0)/0]×100% (2)

1.8.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Saiga等[20]的方法。取不同質(zhì)量濃度(0.25、0.5、1、2、4 mg/mL) 的樣品溶液2 mL和2×10–4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液2 mL，加入試管中搖勻，室溫下密閉靜置30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)得吸光度X；以蒸餾水替代樣品溶液測(cè)定吸光值0；以蒸餾水替代DPPH測(cè)定吸光值X0。根據(jù)公式(2)計(jì)算DPPH自由基的清除率。重復(fù) 3次，取平均值。

1.8.3 羥基自由基清除率的測(cè)定

參照白生文等[21]的方法，采用水楊酸-硫酸亞鐵法測(cè)定。在試管中依次加入9 mmol/L的水楊酸- 乙醇溶液、9 mmol/L的FeSO4溶液、不同質(zhì)量濃度(0.25、0.5、1、2、4 mg/mL) 的樣品溶液和 8.8 mmol/L的H2O2溶液各1 mL，最后加蒸餾水補(bǔ)至15 mL，搖勻，置于37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度X；以蒸餾水1 mL替代樣品溶液測(cè)定吸光度0；以蒸餾水1 mL替代H2O2測(cè)定吸光度X0。根據(jù)公式(2)計(jì)算清除率。重復(fù)3次，取平均值。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 扁桃斑鳩菊葉粉末添加量

扁桃斑鳩菊葉粉末對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，扁桃斑鳩菊葉粉末在一定的劑量范圍內(nèi)，可以顯著提高(<0.05)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)量。當(dāng)粉末添加量為0.8 g時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高。進(jìn)一步增加扁桃斑鳩菊葉添加量時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)量有所下降。因此，在發(fā)酵時(shí)添加0.8 g扁桃斑鳩菊葉粉末較為適宜。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大。發(fā)酵時(shí)間大于8 d時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量沒(méi)有進(jìn)一步上升。因此，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間選取8 d較為合適。

2.1.3 pH

發(fā)酵pH對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，在pH為7.0時(shí)，發(fā)酵液中多糖含量達(dá)到最高。當(dāng)pH過(guò)酸或過(guò)堿，胞外多糖的產(chǎn)量均有所降低。因此，選取發(fā)酵初始pH值為7.0較為適宜。

圖1 扁桃斑鳩菊葉粉末添加量對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.4 接種量

蛹蟲(chóng)草液體菌種接種量對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，當(dāng)接種量為5.0 mL時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高。因此，接種量為5.0 mL時(shí)較為適宜。

2.2 液體發(fā)酵正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果單一，所以本研究試驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取粉末添加量、發(fā)酵時(shí)間、pH和接種量中較優(yōu)良的3個(gè)水平進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)(表2)。

圖3 pH對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖4 接種量對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的影響

從表2可以看到，粉末添加量中k2最大，發(fā)酵時(shí)間中k3最大，pH中k1最大，接種量中k2最大，所以可以得出液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳條件為：粉末添加量為0.8 g、發(fā)酵時(shí)間為9 d、pH為6.5、接種量為5.0 mL。在最佳條件下，胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)到(5.24±0.28) mg/mL。

進(jìn)一步對(duì)極差進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，4種影響因素中，粉末添加量的極差最大，為2.25，接種量次之，表明發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的過(guò)程中，主要的影響因素是粉末添加量，其次是接種量。通過(guò)方差分析可以發(fā)現(xiàn)(表3)，粉末添加量的值最大，為306.330，其次是接種量，值為30.558，pH的值最小，為8.976。所以4種因素的顯著性差異由大到小順序?yàn)椋悍勰┨砑恿?接種量>發(fā)酵時(shí)間>pH。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.3 添加扁桃斑鳩菊葉與未添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量對(duì)比

為驗(yàn)證扁桃斑鳩菊葉對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖產(chǎn)量的提升效果，實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化得到的最佳條件基礎(chǔ)上，設(shè)置了未添加扁桃斑鳩菊葉粉末的空白對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)條件控制上，空白組除了未添加扁桃斑鳩菊葉，其他條件均相同，每組重復(fù)5次。結(jié)果表明，扁桃斑鳩菊葉能夠顯著地提高(<0.05) 蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量，其與未添加扁桃斑鳩菊葉的空白組胞外多糖產(chǎn)量相比提高了約205.20% (圖5)。

為確定扁桃斑鳩菊葉本身含有的多糖是否會(huì)對(duì)發(fā)酵液胞外多糖含量測(cè)定造成影響，實(shí)驗(yàn)對(duì)扁桃斑鳩菊葉本身的多糖含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)扁桃斑鳩菊葉本身的多糖含量極低，加之扁桃斑鳩菊葉添加量很少(8 g/L)，并且發(fā)酵是在25 ℃進(jìn)行，因此扁桃斑鳩菊葉溶出的多糖對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖含量的測(cè)定幾乎沒(méi)有影響。

2.4 胞外多糖紅外光譜分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)添加了扁桃斑鳩菊葉和未添加扁桃斑鳩菊葉的發(fā)酵胞外多糖的紅外光譜進(jìn)行了分析。從圖6可以發(fā)現(xiàn)，添加扁桃斑鳩菊葉后生產(chǎn)得到的胞外多糖與未添加扁桃斑鳩菊葉生產(chǎn)得到的胞外多糖紅外光譜主要特征吸收峰一致，表明扁桃斑鳩菊葉對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較小。

圖5 最優(yōu)條件驗(yàn)證及其與未添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵多糖含量比較

圖6 添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵多糖與未添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵多糖的紅外光譜比較

2.5 胞外多糖抗氧化活性分析

通過(guò)上述紅外光譜分析，我們發(fā)現(xiàn)了扁桃斑鳩菊葉對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較小，但是否會(huì)對(duì)它的活性產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步探究。因此，我們進(jìn)一步對(duì)添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵與未添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖抗氧化活性進(jìn)行了對(duì)比分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這兩種胞外多糖對(duì)ABTS、DPPH以及羥基自由基清除能力相近(圖7)，表明扁桃斑鳩菊葉對(duì)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵胞外多糖的抗氧化活性影響較小。

3 討論

微生物發(fā)酵技術(shù)是快速獲取目標(biāo)菌株活性物質(zhì)的重要手段，但是采用常規(guī)的發(fā)酵方式往往很難做到快速生產(chǎn)的同時(shí)又實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)。藥用真菌液體雙向發(fā)酵技術(shù)是一種通過(guò)向培養(yǎng)基中添加中藥材成分來(lái)促進(jìn)目標(biāo)菌株生產(chǎn)活性物質(zhì)，并促使藥性基質(zhì)在真菌酶作用下產(chǎn)生新活性成分的技術(shù)[22-23]，受這種模式的啟發(fā)，本研究嘗試通過(guò)向蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的扁桃斑鳩菊葉，來(lái)提高蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)量。

圖7 添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵多糖與未添加扁桃斑鳩菊葉發(fā)酵多糖的抗氧化活性比較

研究首先探索了發(fā)酵的單因素條件，對(duì)于扁桃斑鳩菊葉粉末添加量，當(dāng)大于0.8 g后，蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量下降，分析其原因，可能是由于扁桃斑鳩菊葉中的某些成分在達(dá)到一定量后會(huì)抑制菌株產(chǎn)胞外多糖活性。在探索發(fā)酵時(shí)間時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)8 d后，發(fā)酵液中的胞外多糖反而有所降低，這可能是由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基無(wú)法提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持菌株生長(zhǎng)，為維持正常的生理活動(dòng)，菌絲體進(jìn)一步消耗了發(fā)酵液中可利用的自身代謝產(chǎn)物。在探究pH對(duì)胞外多糖產(chǎn)量影響的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH過(guò)酸或過(guò)堿時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)量均會(huì)明顯下降，這可能是由于過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境抑制了蛹蟲(chóng)草中產(chǎn)生多糖的酶活性。對(duì)于蛹蟲(chóng)草液體菌種接種量，接種量過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，不利于胞外多糖的產(chǎn)生；接種量過(guò)少，菌株在有限的時(shí)間無(wú)法充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成胞外多糖，因此，在發(fā)酵生產(chǎn)中要合理控制接種量。

經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，我們得到了液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)發(fā)酵條件：扁桃斑鳩菊葉粉末添加量8 g/L、發(fā)酵時(shí)間9 d、pH 6.5、接種量 5.0 mL，在此條件下，蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到(5.24±0.28) mg/mL。在以往的報(bào)道中，也有研究人員嘗試通過(guò)添加微量金屬元素或生長(zhǎng)素來(lái)促進(jìn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)。2009年，周毅峰等[24]發(fā)現(xiàn)添加適量的硒可以有效地促進(jìn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)生，在最佳添加量下，胞外多糖的產(chǎn)量相比未添加硒的空白對(duì)照組提高了約77%。2017年，鄭鑫等[25]研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素α-萘乙酸(NAA) 可以促進(jìn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的產(chǎn)生，在最優(yōu)添加量下，胞外多糖產(chǎn)量相比于未加生長(zhǎng)素的空白組提高了約80%。在本研究中，扁桃斑鳩菊葉可以顯著促進(jìn)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的生產(chǎn)，與未添加扁桃斑鳩菊葉的空白組胞外多糖產(chǎn)量相比提高了約205.20%。

為了解添加扁桃斑鳩菊葉后是否會(huì)對(duì)蛹蟲(chóng)草胞外多糖的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)最后對(duì)添加扁桃斑鳩菊葉與未添加扁桃斑鳩菊葉生產(chǎn)的胞外多糖紅外光譜和抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示添加扁桃斑鳩菊葉后的胞外多糖與未添加扁桃斑鳩菊葉的胞外多糖紅外主要吸收峰一致，并且對(duì)ABTS、DPPH以及羥基自由基的清除能力相近，說(shuō)明扁桃斑鳩菊葉對(duì)蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖結(jié)構(gòu)和抗氧化活性影響較小，可以作為一種新的添加劑用于蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵中胞外多糖的高效生產(chǎn)。關(guān)于扁桃斑鳩菊葉是如何促進(jìn)蛹蟲(chóng)草產(chǎn)生胞外多糖以及是何種成分發(fā)揮著主要作用，還有待后期實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

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Production of antioxidative exopolysaccharides ofwithleaves in substrate

Ruolin Hou1, Lin Li2, Kaikai Xiang2, Xiaoping Wu3, Wenxiong Lin2, Mingfeng Zheng1, and Junsheng Fu2

1 College of Food Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China 2 College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China 3 Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

exopolysaccharides (EPS) have many pharmacological activities such as boosting immunity and antifatigue. To obtain EPS efficiently, we added moderateleaf powder as inducer to the fermentation medium to promote the production ofEPS and studied the infrared absorption spectrum and antioxidant activities of the EPS after optimization. The optimum liquid fermentation conditions were as follows: addition ofleaf powder of 8 g/L, fermentation duration of 9 d, initial pH of 6.5, inoculation quantity of 5.0 mL. Under such a condition, the yield ofEPS reached (5.24±0.28) mg/mL, increased by 205.20% compared to the control group without addingleaf powder. Results of infrared analysis and antioxidant activity showed that theleaves had little effect on the structure and activities ofEPS. The results of this research suggest thatleaf can enhance the production ofEPS effectively, and provides a novel method for efficient production of EPS in.

,leaf, exopolysaccharides, antioxidant

10.13345/j.cjb.180353

September 2, 2018;

October 29, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 81503187), the National Key R&D Program of China (No. 2018YFD0400200), the Funding for the Construction of Modern Seed Industry Engineering Research Institute of Fujian Agriculture and Forestry University.

Junsheng Fu. Tel: +86-591-83789367; E-mail: fujunsheng81@163.com

Mingfeng Zheng. Tel: +86-591-83789348; E-mail: vanzheng@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81503187)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (No. 2018YFD0400200)，福建農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代種業(yè)工程研究院建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)