血清維生素K2、補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3和核心結(jié)合因子a1與冠狀動(dòng)脈鈣化的相關(guān)性研究

劉海玲 徐炳柱 郭兆文 馮景輝

151100 肇東市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(劉海玲、徐炳柱、郭兆文)；150007 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部二病房(馮景輝)

血管鈣化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，近年認(rèn)為主要?dú)w因于血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)表型的轉(zhuǎn)化[1]。維生素K2(vitamin K2，VK2)與血管鈣化的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)，其可通過多種維生素K依賴蛋白限制鈣磷晶體生長、抑制VSMC凋亡，從而抑制血管鈣化形成。而補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3(complement C1q tumor necrosis factor related protein 3，CTRP3)是15種CTRP中的1種，可通過激活ERK1/2途徑上調(diào)骨鈣蛋白(osteopontin，OPN)、骨形態(tài)蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)和核心結(jié)合因子a1(core binding factor a1，Cbfa1)等成骨標(biāo)記物的表達(dá)，降低收縮表型標(biāo)記物sm22a和SM-α-actin的表達(dá)而促進(jìn)VSMC分化[2]。此外，Cbfa1是成骨細(xì)胞的調(diào)控因子，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志，在致鈣化因素作用下分化的VSMC可增加Cbfa1的表達(dá)從而促進(jìn)VSMC成骨樣分化[3]。而Otani等[4]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，分化的VSMC表達(dá)的CRTP3可增加Cbfa1的表達(dá)。本研究旨在探討人血清中VK2、CTRP3和Cbfa1水平與冠狀動(dòng)脈鈣化(coronary artery calcification，CAC)的關(guān)系，為今后預(yù)測和防治血管鈣化提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為病例對(duì)照研究。選取2016年6～12月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院并因胸痛行冠狀動(dòng)脈64排CT造影(coronary computed tomography angiography，CCTA)檢查的患者100例，其中男性50例，女性50例，年齡35～86歲，平均(59.4±10.4)歲。排除肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、心肌病、心臟瓣膜病、惡性腫瘤、甲狀腺及甲狀旁腺疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、既往有過冠狀動(dòng)脈支架置入和旁路移植的患者。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

所有入選患者均于入院次日清晨空腹采集肘靜脈血5 ml，以3 000 r/min離心10 min，取上清液速凍-80℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清CTRP3、 Cbfa1和VK2水平，試劑盒購自上海博研生化試劑有限公司。收集患者病例資料包括姓名、性別、吸煙史、高血壓和糖尿病病史、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)、載脂蛋白A(ApoA)、載脂蛋白B(ApoB)、鈣離子(Ca2+)和磷離子(P+)等。

采用雙源CT行CCTA并計(jì)算冠狀動(dòng)脈鈣化積分(coronary artery calcium score，CACS)。檢查前將患者心率控制在90次/min以下。鈣化積分由鈣化面積、體積及血管分布決定，采用Agatston及其修正方法計(jì)算，鈣化積分=鈣化灶CT峰值×鈣化面積，130～199 Hu記為1分，200～299 Hu記為2分，300～399 Hu記為3分，≥400 Hu記為4分。一支冠狀動(dòng)脈血管的鈣化總積分等于該支血管各鈣化灶積分的總和，冠狀動(dòng)脈主要分支包括左主干、左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈等，該過程由智能積分軟件參與完成。

根據(jù)CCTA結(jié)果將入選患者分為CAC組60例和非冠狀動(dòng)脈鈣化組(NCAC組)40例。其中，CAC組患者根據(jù)CACS又分為3組：輕度組(CACS<10分)23例，其中男性12例，女性11例，平均年齡(59.6±9.8)歲；中度組(CACS 11～400分)19例，其中男性10例，女性9例，平均年齡(62.2±12.1)歲；重度組(CACS>400分)18例，其中男性11例，女性7例，平均年齡(64.0±10.2)歲。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

與NCAC組比較，CAC組患者年齡偏大、合并高血壓和糖尿病更多，血清TC、空腹血糖、Ca2+、Hcy和ApoB/ApoA明顯升高，而ApoA、HDL-C和VK2水平顯著降低(均為P<0.05)，見表1。

2.2 不同程度CAC組間血清VK2水平比較

NCAC組、輕度和中度CAC組的血清VK2水平明顯高于重度CAC組[(3.57 ±0.59)μg/L、(3.67 ±0.40)μg/L和(3.28 ±0.80)μg/L 比 (2.40 ±0.54)μg/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3 VK2、CTRP3和Cbfa1之間以及與其他變量的相關(guān)分析

相關(guān)分析顯示，血清VK2水平與糖尿病呈負(fù)相關(guān)，血清CTRP3水平與空腹血糖呈負(fù)相關(guān)，血清Cbfa1與ALP呈負(fù)相關(guān)(均為P<0.05)，見表2。

2.4 多因素logistic回歸分析CAC的獨(dú)立預(yù)測因素

Logistic回歸分析顯示，VK2為CAC的獨(dú)立影響因素，可作為CAC的一個(gè)預(yù)測因子(OR：0.251，95%CI：0.074～0.844，P=0.025)，見表3。

表1 CAC組和NCAC組臨床資料比較

注：ALP：堿性磷酸酶；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；ApoA：載脂蛋白A；ApoB：載脂蛋白B；ApoB/ApoA：載脂蛋白B/載脂蛋白A；FBG：空腹血糖；Ca2+：鈣離子；P+：磷離子；Hcy：同型半胱氨酸；VK2：維生素K2；CTRP3：C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3；Cbfa1：核心結(jié)合因子a1

表2 CTRP3、Cbfa1和VK2之間及與其他變量的相關(guān)分析

注：TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；FBG：空腹血糖；ALP：堿性磷酸酶；Ca2+：鈣離子；P+：磷離子；VK2：維生素K2；CTRP3：C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3；Cbfa1：核心結(jié)合因子a1

表3 多因素logistic回歸分析CAC的獨(dú)立預(yù)測因素

注：ApoA：載脂蛋白A；ApoB/ApoA：載脂蛋白B/載脂蛋白A；Hcy：同型半胱氨酸；VK2：維生素K2

3 討論

CAC可使血管壁僵硬度和脆性增加，進(jìn)而引起血管壁破裂、出血及血栓形成，最終導(dǎo)致不良心血管事件的發(fā)生。目前，有關(guān)CAC的形成機(jī)制越來越受到關(guān)注，無論是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)還是臨床試驗(yàn)也越來越多。生物標(biāo)記物與CAC之間的聯(lián)系，已成為人們研究的熱點(diǎn)話題。

維生素K是一種脂溶性維生素，主要有兩種形式：VK1和VK2。近年在骨組織及血管中以VK2研究較多，其可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨鈣素(osteocalcin，OCN)磷酸化以及增加ALP活性和胰島素樣生長因子1而刺激成骨形成[5]。近期發(fā)現(xiàn)，維生素K依賴蛋白除凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和OCN外，還包括基質(zhì)Gla蛋白、富含Gla蛋白和生長停滯特異基因6等，它們的γ羧化均需要VK2的參與[6]?；|(zhì)Gla蛋白可通過與鈣磷晶體結(jié)合而限制其生長，也可通過抑制BMP-2和BMP-4途徑進(jìn)而抑制血管鈣化形成[7]；生長停滯特異基因6可通過γ羧化刺激抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2的活性從而抑制VSMC凋亡；富含Gla蛋白含有大量的Gla殘基，與羥磷灰石結(jié)合可調(diào)節(jié)細(xì)胞外Ca2+代謝[8]。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VK2通過抗氧化應(yīng)激作用可減少活性氧的產(chǎn)生從而抑制血管鈣化[9]。在本研究中，血清VK2水平在CAC組明顯降低，與CAC呈負(fù)相關(guān)。相關(guān)分析顯示，血清VK2水平與糖尿病呈負(fù)相關(guān)，然而糖尿病患者易伴有血管鈣化，糖尿病患者中低水平的VK2又進(jìn)一步加重了CAC的形成。Logistic回歸分析顯示，血清VK2水平降低可獨(dú)立預(yù)測CAC。Scheiber等[10]實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充VK2(甲萘醌-7)可抑制小鼠主動(dòng)脈鈣化的發(fā)展，因此給予機(jī)體補(bǔ)充VK2有可能延緩血管鈣化進(jìn)展、減少血管鈣化發(fā)生，可能成為未來防治血管鈣化的一線用藥。

CTRP3又稱為CORS-26、Cartonectin、Cartducin和CIATNF3。VSMC可誘導(dǎo)CTRP3 mRNA表達(dá)，表達(dá)的CTRP3又可通過自分泌和旁分泌激活ERK1/2和P38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)VSMC增殖，最終參與血管鈣化[11]。Yoo等[12]研究表明，循環(huán)中CTRP3水平與TC、TG、空腹血糖和舒張壓等呈負(fù)相關(guān)。此外，Zhou等[13]體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，CTRP3可直接上調(diào)VSMC表達(dá)BMP-2、OPN和Cbfa1等成骨表型標(biāo)記物，還可促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈VSMC產(chǎn)生活性氧，反之又可激活ERK1/2-Runx2信號(hào)通路進(jìn)一步增強(qiáng)VSMC成骨樣分化。截至目前，尚未有研究報(bào)道循環(huán)中CTRP3水平與血管鈣化的相關(guān)性，本研究分析了人血清中CTRP3水平與CAC的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CAC組和NCAC組血清CTRP3水平無顯著差異，表明循環(huán)中CTRP3水平并不等同于血管鈣化部位VSMC表達(dá)的CTRP3水平，血清CTRP3水平與CAC無明顯關(guān)系，尚不能成為CAC的一種影響因素。

Cbfa1又稱為Pebp2αA或Aml3，最近被命名為Runx2，被認(rèn)為是VSMC向成骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞表型分化的早期調(diào)控因子之一，其可通過增加OPN、OCN、核因子κB受體活化因子配基和ALP等物質(zhì)表達(dá)來促進(jìn)VSMC表型分化，分化的VSMC又可增加Runx2的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)血管鈣化[14]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，β-甘油磷酸誘導(dǎo)VSMC發(fā)生鈣化后，Cbfα1的表達(dá)于第10天為對(duì)照組的5～6倍[15]。迄今為止，在動(dòng)物鈣化模型上證實(shí)了Cbfa1促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)化，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的VSMC又可增加Cbfa1的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)血管鈣化，而且鈣化越嚴(yán)重VSMC表達(dá)Cbfa1越多。本研究首次檢測了血清Cbfa1水平，并分析其與CAC的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CAC組血清Cbfa1水平較NCAC組無明顯降低，表明循環(huán)中Cbfa1水平并不代表血管鈣化部位Cbfa1表達(dá)的水平，血清Cbfa1水平不能作為CAC的一個(gè)標(biāo)記物。

血脂異常促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[16]。近年來，有關(guān)ApoA、ApoB和ApoB/ApoA與冠心病的關(guān)系越來越受到關(guān)注。喬麗[17]研究發(fā)現(xiàn)，ApoA與CAC的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，ApoB與CAC的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ApoB在CAC和NCAC兩組間無顯著差異，而ApoA在CAC組顯著降低。目前，關(guān)于ApoB/ApoA與CAC的相關(guān)性還未有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)CAC組ApoB/ApoA顯著升高，但回歸分析顯示ApoA和ApoB/ApoA不能作為CAC的獨(dú)立預(yù)測因素，可能與納入者入院前已經(jīng)服用降脂藥物而影響了載脂蛋白的水平有關(guān)，還可能與樣本量少有關(guān)。

CAC是多因素共同作用的結(jié)果，其鈣化程度嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。然而，截至目前，尚未有針對(duì)CAC的有效治療方案。因此，研究和探索靶向物質(zhì)與CAC的關(guān)系，可能成為未來防治CAC的一個(gè)新介入點(diǎn)。本研究為病例對(duì)照研究，不可避免會(huì)存在入選對(duì)象的選擇上偏倚，且樣本量也相對(duì)較少，一定程度上會(huì)影響研究結(jié)果。因此，為了進(jìn)一步確定以上結(jié)論，尚需要更大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，并需要更深入的探討和研究。

利益沖突：無