神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞EphA4/ephrin通路調(diào)控小膠質(zhì)細胞介導的缺血后炎性損傷

魏慧星，陳萍萍，吳鋼，楊錦珊

（福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州350000）

Eph 受體家族是目前已知最大的受體蛋白酪氨酸激酶家族，Eph 受體及其配體ephrin 構(gòu)成的雙向信號系統(tǒng)能同時向受體和配體所在的細胞傳導信號[1]。EphA4受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達最為豐富的EphA受體，主要分布于神經(jīng)元[2-4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，EphA4受體在缺血后早期即出現(xiàn)蛋白表達水平的上調(diào)[5]，提示EphA4/ephrin可能通過調(diào)節(jié)炎性損傷，參與缺血性腦損傷早期的病理過程，但具體機制仍不明確。本研究建立神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)體系和糖氧剝奪再復氧模型，使用預聚集化的EphA4-Fc激動小膠質(zhì)細胞ephrin配體，從離體水平檢測缺血再灌注后的細胞凋亡、小膠質(zhì)細胞增殖活化和亞型極化以及小膠質(zhì)細胞功能的變化，旨在研究神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞間EphA4/ephrin 信號通路介導的腦缺血后炎性損傷的分子機制，為缺血性腦損傷的治療提供新思路。

材料與方法

1 實驗動物

出生24h內(nèi)的C57BL/6乳鼠購自福建醫(yī)科大學動物實驗中心 [SYXK (閩)2012. 0001]。

2 主要試劑與儀器

DMEM/F12、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、HBSS、EBSS購自美國Hyclone公司；Neurobasal培養(yǎng)基、B27購自美國Gibco公司；多聚賴氨酸、DAPI、谷氨酸、99%甘油、Triton X-100購自美國Sigma公司；BSA、CHAPS購自美國Amresco公司；重組小鼠EphA4-Fc嵌合體購自美國R&D systems公司；重組人IgG(Fc)、山羊抗人IgG(Fc)抗體、CY3標記的山羊抗兔抗體購自美國Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；兔抗小鼠EphA4抗體、兔抗小鼠MAP-2抗體、兔抗小鼠iNOS抗體購自美國Abcam公司；兔抗小鼠GAPDH抗體購自武漢博士德公司；兔抗小鼠Iba-1抗體購自日本W(wǎng)ako公司；兔抗小鼠Arg-1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物試劑公司；PVDF膜（0.45μm）購自美國Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強化學發(fā)光法（ECL）試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Annexin V- FITC 凋亡檢測試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司；總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司； 1st strand cDNA合成試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自日本Takara公司；IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β細胞因子ELISA檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；FC 500流式細胞儀購自美國Beckman公司；熒光顯微鏡（BX51）購自日本Olympus公司；臺式低溫離心機購自德國Eppendorf公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Syngene公司; ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國 Applied Biosystems公司；Infinite 200多功能熒光酶標儀購自奧地利Tecan公司。

3 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

于無菌條件下取新生24h 內(nèi)野生型C57 BL/6小鼠大腦，剔除腦膜和血管后小心分離雙側(cè)海馬，用顯微剪剪成1mm×1mm×1mm的小塊，以終濃度0.125%的胰蛋白酶消化后吹打成單細胞懸液，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，800r/min×8min離心并小心棄去上清后以含2% B27、1% 雙抗和 0.5mmol/L L-谷氨酸的Neurobasal培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于多聚賴氨酸包被的24孔板(105細胞/孔)或96孔板(5×104細胞/孔)，定時換液，選取第5d 的細胞用于實驗，MAP-2 免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元。

4 小膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)

取出生24h 內(nèi)的乳鼠大腦，消化、過濾、離心、以含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后，以5×106/ml接種至多聚賴氨酸包被的75cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)7～9d 至膠質(zhì)細胞分層，200r/min 振蕩2h，收集上清液離心、接種，繼續(xù)培養(yǎng)5d 后，Iba1 免疫熒光染色鑒定小膠質(zhì)細胞。

5 神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)及糖氧剝奪再復氧（OGD/R）

神經(jīng)元和純化后的小膠質(zhì)細胞（小膠質(zhì)細胞：神經(jīng)元=1∶2）進行混合培養(yǎng)。小膠質(zhì)細胞種入神經(jīng)元后3h后棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS漂洗培養(yǎng)瓶2遍后，加入無糖的DMEM緩沖液，置于含有93% N2/5% CO2/2% O2的三氣培養(yǎng)箱中，進行氧糖剝奪培養(yǎng)60min。隨后棄去無糖的DMEM緩沖液，用無菌PBS漂洗培養(yǎng)瓶2遍后，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基，重新移入含95% O2和5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱復氧復糖培養(yǎng)24h后收取細胞。

6 實驗分組和干預藥物的配置

實驗分為正常對照組（Control）、糖氧剝奪再復氧組（OGD/R）、OGD/R+溶劑對照組（Vehicle）和OGD/R+EphA4-Fc干預組4組。

20μg重組小鼠EphA4-Fc嵌合體與48mg羊抗人IgG-Fc抗體溶于30μl PBS4℃孵育過夜，Vehicle對照組以人IgG-Fc片段代替重組小鼠EphA4-Fc嵌合體孵育過夜。OGD時及復氧后均向培養(yǎng)基內(nèi)分別加入終濃度3μg/ml的預聚集化的EphA4-Fc或IgG-Fc

7 免疫熒光染色

細胞爬片晾干后冰甲醇固定15min，0.25%Triton X-100/PBS 破膜液室溫孵育15min，10% BSA-/PBS 封閉1 h，由一抗（兔抗小鼠EphA4，1∶200或兔抗小鼠Iba-1，1∶400）4℃孵育過夜，二抗（CY3標記的山羊抗兔抗體，1∶400）室溫孵育1h，PBS漂洗后滴加DAPI（1μg/ml）室溫避光孵育10min染核，PBS漂洗后甘油封片，Olympus熒光顯微鏡(BX51型)顯像并拍照。小膠質(zhì)細胞計數(shù)：在高倍（40倍物鏡）熒光顯微鏡下每細胞爬片隨機選取5個視野，計數(shù)Iba-1陽性細胞（個/視野），并取平均數(shù)。

8 流式細胞凋亡檢測

細胞消化后，冰PBS漂洗2遍，以1×Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸至 1～5×106細胞 /ml。每 96μl細胞混懸液加入1μl Annexin V-FITC和12.5μl 碘化丙啶（PI），室溫避光孵育10min，流式細胞儀檢測凋亡細胞。正?；罴毎鸄nnexin V及PI均低染, 分布在流式細胞分析圖的左下區(qū)(Q4；早期凋亡細胞Annexin V高染而PI低染分布在圖的右下區(qū)(Q3)；晚期凋亡細胞annexin V及PI 均高染, 分布在圖的右上區(qū)(Q2)；壞死細胞Annexin V低染而PI高染，分布在圖的左上區(qū)（Q1），將早期凋亡細胞百分數(shù)(Q3)和晚期凋亡細胞百分數(shù)（Q2）之和稱為總凋亡率。

9 實時熒光定量PCR

Trizol 提取總 RNA，樣品在-80℃保存，并取部分樣品測RNA的質(zhì)量，OD260/280在1.8～2.0之間，可用于下一步實驗。然后按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。進行熒光定量PCR，采用20μl的反應(yīng)體系，Master Mix 10μl、上下游引物各 0.5μl、cDNA 模板 2μl、SYBR Green 1μl、ddH20 6μl。iNOS、Arg-1 和 GAPDH 引物由上海生工設(shè)計并合成,引物序列見（圖3A）。擴增條件為：95℃預變性10min，進入循環(huán)，95℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s共循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后用熒光定量分析軟件繪制擴增曲線以及熔解曲線，通過對熔解曲線的分析來檢測產(chǎn)物特異性。建立標準曲線后，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算樣本的相對定量值。

10 Western blotting

在糖氧剝奪再復氧后24h收取細胞加入CHAPS裂解液冰上充分裂解細胞30min，搜集細胞裂解液置于4℃離心機12000r/min離心10min，搜集上清以BCA法測定蛋白濃度，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封 1.5h，加入一抗 iNOS(1∶400)，Arg-1（1∶1000），GAPDH（1∶500），4℃搖床孵育過夜，TBST漂洗4次后加入二抗，室溫孵育1h，TBST漂洗4次，超敏ECL發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測iNOS，Arg-1和內(nèi)參GAPDH的蛋白表達水平，Gene Genius Bio-Imaging System凝膠成像儀拍照，并利用Image J軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。

11 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

在規(guī)定的時間點，搜集細胞上清，4℃ 3000r/min離心20min，用無菌管收集細胞上清，嚴格按照ELISA試劑盒操作手冊的步驟進行操作，并繪制標準曲線，分別計算細胞上清IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β 水平（pg/ml）。

12 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量結(jié)果以（ˉx±sd）表示，隨后進行單因素方差分析，并使用Turkey法進一步進行組間比較，P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)元表達EphA4受體

原代神經(jīng)元免疫熒光染色顯示，幾乎100%的原代神經(jīng)元表達EphA4受體，EphA4受體呈點狀彌漫分布于原代神經(jīng)元細胞胞膜和細胞質(zhì)，未見其表達于胞核（圖1）。

圖1原代神經(jīng)元EphA4表達的免疫熒光檢測（DAPI復染）。標尺，100μmFig. 1 Immunofluorescent examination for expression of EphA4 in the primary neurons (DAPI counterstaining). Scale bar, 100μm

2 EphA4-Fc處理促進OGD/R誘導的神經(jīng)元細胞凋亡和小膠質(zhì)細胞增殖

Annexin V-PI 流式細胞術(shù)分析顯示，在OGD/R后24h，OGD/R組總凋亡率（16.19%）較Control組（8.23%）明顯上升；EphA4-Fc干預組總凋亡率（23.93%）較Vehicle（IgG）對照組（16.87%）顯著升高，表明EphA4-Fc干預進一步加重OGD/R導致的細胞凋亡（圖2A，圖2C）。

Iba-1免疫熒光染色結(jié)果顯示，在OGD/R后小膠質(zhì)細胞數(shù)目增加、胞體增大，表現(xiàn)為增殖、活化，而EphA4干預組較Vehicle（IgG）對照組小膠質(zhì)細胞增殖、活化更為顯著（圖2B，圖2D）。

圖2 EphA4-Fc處理對OGD/R導致的細胞凋亡和小膠質(zhì)細胞增殖的影響 。A，細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測； B1-B4，Iba-1免疫熒光染色顯示小膠質(zhì)細胞的數(shù)目和形態(tài)（標尺，100μm）；C，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的統(tǒng)計學分析；D，小膠質(zhì)細胞計數(shù)（單位：個/視野）的統(tǒng)計學分析；**，P ＜0.01 vs Control組；##， P ＜ 0.01 vs Vehicle 組Fig. 2 Effects of EphA4-Fc treatment on apoptosis of neuron and proliferation of microglia induced by ODG/R. A, representative results of flow cytometry analysis for apoptosis; B1 to B4, the number and morphology of primary microglia detected by Iba-1 immunofluorescent staining (scale bar, 100μm);C, statistical analysis for apoptotic rate detected by flow cytometry; D, statistical analysis for microglia number; **, P ＜0.01 vs Control group; ##, P ＜0.01 vs Vehicle group

3 EphA4-Fc處理促進OGD/R后小膠質(zhì)細胞向M1亞型極化

進一步應(yīng)用實時熒光定量PCR和Western blot分析小膠質(zhì)細胞亞型標志物iNOS和Arg-1表達顯示，OGD/R后iNOS的mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)，而EphA4干預組這一趨勢較Vehicle（IgG）對照組更為顯著；與之相反，OGD/R后Arg-1的mRNA和蛋白表達水平均明顯下調(diào)，而EphA4干預組較Vehicle（IgG）對照組下調(diào)更為顯著。由此結(jié)果提示EphA4-Fc干預可促進OGD/R后的小膠質(zhì)細胞向M1亞型極化（圖3）。

應(yīng)用ELISA法對細胞上清的細胞因子檢測發(fā)現(xiàn)，OGD/R 后 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 和TGF-β水平均顯著上升；然而，在EphA4-Fc干預組，IL-1β、IL-6和TNF-α水平較Vehicle（IgG）對照組明顯下降，IL-4、IL-10和TGF-β水平較Vehicle（IgG）對照組進一步上升，其中IL-4和TGF-β的水平升高具有統(tǒng)計學意義（表1，圖4）。

圖3 EphA4-Fc處理對OGD/R后小膠質(zhì)細胞亞型極化的影響。小膠質(zhì)細胞亞型標記物iNOS（M1型）和Arg-1（M2型）的引物序列 （B-C）A，EphA4-Fc處理對OGD/R后小膠質(zhì)細胞iNOS（A1）和Arg-1（A2）mRNA表達影響的qRT-PCR分析；B和C，EphA4-Fc處理對OGD/R后小膠質(zhì)細胞iNOS（B1和B2）和Arg-1（C1和C2）表達影響的Western blot檢測與統(tǒng)計學分析；*，P ＜0.01 vs Control組；##， P ＜ 0.01 vs Vehicle組Fig. 3 Effects of EphA4-Fc treatment on ODG/R induced polarization of microglia subtype. Primers sequences(B-C) of microglia subtype marker iNOS(M1 type) and Arg-1(M2 type) used for RT-PCR A, qRT-PCR analysis for the effect of EphA4-Fc treatment on expression of iNOS mRNA (A1)and Arg1 mRNA (A2) in the microglia after OGD/R; B and C, Western blot detection and statistical analysis for the effect of EphA4-Fc treatment on expression of iNOS (B1 and B2) and Arg1 (C1 and C2) in the microglia after OGD/R; **, P ＜0.01 vs Control group; ##, P＜ 0.01 vs Vehicle group

表1 培養(yǎng)細胞上清細胞因子水平（pg/ml）Tab.1 Content of cytokines in cultured cells (pg/ml)

圖4 EphA4-Fc處理對OGD/R后細胞上清細胞因子分泌的影響。A, IL-1β水平的統(tǒng)計學分析；B，IL-6水平的統(tǒng)計學分析；C，TNF-α水平的統(tǒng)計學分析；D，IL-4水平的統(tǒng)計學分析；E，IL-10水平的統(tǒng)計學分析；F，TGF-β水平的統(tǒng)計學分析；**，P＜0.01 vs Control組；#,0.01＜P＜ 0.05 vs Vehicle組；##，P＜ 0.01 vs Vehicle組Fig. 4 Effect of EphA4-Fc treatment on content of cytokines assessed by ELISA in cultured cells after OGD/R. A, statistical analysis for content of IL-1β; B, statistical analysis for content of IL-6 ; C, statistical analysis for content of TNF-α ; D, statistical analysis for content of IL-4 (D); E, statistical analysis for content of IL-10; F, statistical analysis for content of TGF-β; **, P＜0.01 vs Control group; #, 0.01＜P＜ 0.05 vs Vehicle group; ##, P＜ 0.01 vs Vehicle group

討 論

腦缺血后的炎性損傷以小膠質(zhì)細胞的聚集、活化和循環(huán)免疫細胞浸潤為主要特點，在腦缺血后病理和轉(zhuǎn)歸過程中扮演重要角色。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的常駐免疫細胞，起源于中胚層，屬于單核巨噬細胞系，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御包括缺血在內(nèi)的各種損傷的第一道防線。小膠質(zhì)細胞活化是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的第一步，腦缺血后活化的小膠質(zhì)細胞遷移至缺血邊緣區(qū)，并展示出“雙刃劍”效應(yīng)?；罨男∧z質(zhì)細胞一方面釋放分泌炎癥因子和細胞毒性物質(zhì)加重組織損傷；另一方面吞噬細胞碎片，分泌抗炎因子和營養(yǎng)因子促進神經(jīng)損傷的修復[6]。

小膠質(zhì)細胞的亞型極化能解釋其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后所展示出的雙重作用?；罨笮∧z質(zhì)細胞極化為不同的表型及功能亞型（M1和M2型），其中M1 型被視作經(jīng)典的炎癥型，通過分泌TNF-α，IL-1β 和IL-6等多種趨化因子和炎癥因子，以清除病原體，但同時炎癥介質(zhì)如NO和氧自由基的釋放如也會導致神經(jīng)毒性，加重神經(jīng)損傷；與之相反，M2型小膠質(zhì)細胞能分泌多種抗炎因子如IL-4、IL-10和TGF-β及神經(jīng)營因子促進神經(jīng)損傷的修復與再生[7]。促進小膠質(zhì)細胞從M1型向M2型極化，可能作為一種有效調(diào)控手段，減輕腦缺血后的炎性損傷、促進神經(jīng)功能的恢復[8]。小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)由許多因素所決定，比如神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞間的相互作用[9]。

在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，EphA4受體在缺血后早期即出現(xiàn)蛋白表達水平的上調(diào)，參與缺血性腦損傷早期的病理過程[5]；此外，有研究表明，EphA4 受體敲除減輕了小鼠脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應(yīng)[10]；另有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷EphA4 受體能降低缺血再灌注腸損傷后的血管通透性[11]，提示EphA4/ephrin 信號通路可能通過調(diào)控缺血后的炎性損傷發(fā)揮作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EphA4受體高表達于原代神經(jīng)元，以預聚集化的EphA4-Fc激動神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞間的EphA4/ephrin逆向通路，發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪再復氧后的小膠質(zhì)細胞增殖、活化進一步增強，此外小膠質(zhì)細胞向M1型極化，炎性介質(zhì)分泌增加，抗炎因子分泌減少，最終導致的細胞凋亡增加。

綜上所述， EphA4受體高表達于神經(jīng)元，并且神經(jīng)元EphA4介導的小膠質(zhì)細胞ephrin逆向通路激活通過促進小膠質(zhì)細胞向M1亞型極化，調(diào)控小膠質(zhì)細胞功能，進而加重OGD/R所致的細胞凋亡。我們的發(fā)現(xiàn)為進一步研究EphA4/ephrin 通路在卒中后神經(jīng)血管單元重塑中的角色，為缺血性腦卒中的治療研究提示了新思路和新靶點。