凡納濱對蝦多酚氧化酶的純化及性質(zhì)分析

鮑俊旺，李 越，翁 凌,2，張凌晶,2，孫樂常,2，曹敏杰,2

( 1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，通稱白對蝦(white shrimp)，是世界上養(yǎng)殖量最大的三大蝦類之一。凡納濱對蝦肌肉中含有多種人體必需氨基酸，而含量最高的是與呈味性質(zhì)相關(guān)的谷氨酸，其次還含有大量的精氨酸及天冬氨酸。此外，對蝦肌肉中還含有不飽和脂肪酸，其中促進人腦智力發(fā)育的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)的相對含量在脂肪酸總量中占比近20%[1]。同時，由于凡納濱對蝦具有生長迅速、環(huán)境適應(yīng)能力強以及肌肉含量高的特點，因此，它在我國沿海地區(qū)占有相當(dāng)大的海水以及淡水養(yǎng)殖份額。廣東省、廣西省、浙江省、福建省等水溫水質(zhì)適宜的省份，已成為我國凡納濱對蝦的重要養(yǎng)殖地和出產(chǎn)地[2]。2016年，我國凡納濱對蝦的養(yǎng)殖總產(chǎn)量達167萬t[3]。

然而，對蝦死后常出現(xiàn)由體內(nèi)多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)作用所引起的黑變現(xiàn)象。黑變現(xiàn)象不僅嚴重影響了對蝦的感官品質(zhì)和新鮮程度，也大幅降低了其商品價值。據(jù)研究，對蝦肝胰腺中的絲氨酸蛋白酶在對蝦死后因肝胰腺破裂而釋放，導(dǎo)致無黑變效應(yīng)的酚氧化酶原(prophenol oxidase，proPO)在絲氨酸蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)化為具有活性的PPO[4-5]。PPO是一種以銅離子為催化中心的金屬氧化酶，可將單酚類物質(zhì)氧化為雙酚類物質(zhì)，而雙酚類物質(zhì)可被進一步氧化，生成具有顏色的醌類物質(zhì)。這些醌類物質(zhì)與蛋白質(zhì)或氨基酸相結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的黑色物質(zhì)，即為引起對蝦黑變的主要原因[6]。

對于蝦類體內(nèi)PPO的研究已有很多報道，如：Simpson等[7]利用親和層析法從白對蝦(Penaeussetiferus)分離獲得分子質(zhì)量為30 ku的PPO；Benjakul等[8]從日本對蝦(Penaeusjaponicus)體內(nèi)分離得到分子質(zhì)量為160 ku的PPO；Zamorano等[9]從長額擬對蝦(Parapenaeuslongirosteis)中分離的PPO分子質(zhì)量為200 ku；Lai等[10]利用分子克隆技術(shù)從凡納濱對蝦中克隆了PPO基因全序列，并推測該酶的分子質(zhì)量為78.1 ku。綜合國內(nèi)外的研究結(jié)果，來源于不同種類的對蝦的PPO分子質(zhì)量在30～200 ku不等，差異很大。更值得關(guān)注的是，從蛋白質(zhì)水平對PPO的研究沒有解決其結(jié)構(gòu)問題，而從基因水平的研究則缺乏酶學(xué)性質(zhì)的分析。鑒于PPO在對蝦保鮮加工中的重要作用，有必要對其理化性質(zhì)做更加深入全面的解析。因此，本研究采用鹽析、DEAE-Cellulose、Phenyl-Sepharose HP、Hi-Trap Capto-Q等多種柱層析方法將凡納濱對蝦PPO進行分離純化，利用質(zhì)譜技術(shù)對PPO的一級結(jié)構(gòu)進行解析，探討不同溫度、pH值、抑制劑對其活性的影響，并對其二級結(jié)構(gòu)作了分析，以期為進一步闡明凡納濱對蝦PPO的特性并有效抑制對蝦的死后黑變提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮活凡納濱對蝦(L.vannamei)，購于廈門集美菜市場。清水洗凈后，置于冰水中猝死，取蝦頭用于實驗。

DEAE-Cellulose，美國Whatman公司產(chǎn)品；Phenyl Sepharose HP、Hi-Trap Capto-Q，美國GE Healthcare公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，立陶宛 Fermentas 公司產(chǎn)品；左旋多巴(L-Dopa)，美國Aladdin公司產(chǎn)品；茶多酚(Tea Polyphenols/GTP)，上海 EKEAR公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純(AR)。

組織搗碎機PT-2100(Kinematica，瑞士)；高速冷凍離心機(Avanti JA-26.5 Beckman，美國)；凝膠成像儀(G-BOX Syngene，英國)；圓二色光譜儀(Chirascan Applied Photophysics，英國)；恒溫水浴鍋(Memmert，德國)；pH計(Sartorius，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 凡納濱對蝦PPO的分離純化

原料的前處理方法參照Nirmal等[12]的方法作適當(dāng)修改，取0.5 kg對蝦頭部剪碎，加入到5倍蝦頭質(zhì)量的冰冷50 mmol/L 磷酸緩沖液(PBS，pH =7.2)中，用組織搗碎機充分搗碎，加入體積分數(shù)0.2%Triton X-100促溶，攪拌靜置后離心(12000g，30 min)。所獲得的上清溶液進行0～40%飽和濃度的硫酸銨鹽析，離心取沉淀。將沉淀用適量的50 mmol/L PBS(pH=7.2)溶解后裝入透析袋中對相同緩沖液充分透析。用DEAE-Cellulose(2.5 cm×15 cm)陰離子交換柱進行分離，并以含0～0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L PBS(pH=7.2)溶液進行線性洗脫，同時測定每個組分中的酶活力及蛋白質(zhì)含量(A280)并收集PPO酶活力較高的組分(粗酶液)。

向粗酶液中加入等體積的1 mol/L (NH4)2SO4，攪拌混合均勻后用0.22 μm膜抽濾。上樣于Phenyl-Sepharose HP(5 mL)疏水層析柱，先用含有0.2 mol/L (NH4)2SO4的緩沖液進行洗脫，后用含0.2～0 mol/L (NH4)2SO4的緩沖液進行線性洗脫，測定每個組分中的酶活力及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的組分。將收集的組分用50 mmol/L PBS(pH=7.2)透析，0.22 μm膜抽濾，上樣于Hi-Trap Capto-Q(5 mL)陰離子交換柱,用含0～0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L PBS(pH=7.2)進行線性洗脫。測定各組分的酶活力及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的組分，用SDS-PAGE鑒定其純度。

1.2.2 PPO的活力測定

PPO的活力測定參照Chen等[13]的方法略作修改。以左旋多巴(L-Dopa)為底物，將50 μL粗酶液加入500 μL含底物L(fēng)-Dopa(15 mmol/L)的緩沖液(pH=6.0)中，在40 ℃下反應(yīng)10 min，用紫外分光光度計迅速測定反應(yīng)液在475 nm處的吸光度值。PPO作用于底物后，在475 nm處釋放出有最大吸光度的物質(zhì)，以該物質(zhì)的濃度來衡量該條件下酶活力的大小。在上述條件下，將每分鐘催化底物使反應(yīng)體系吸光度值增加0.001所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.3 SDS-PAGE

采用聚丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)為7.5%的凝膠進行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)束后進行硝酸銀染色，用凝膠成像儀記錄染色后的結(jié)果。

1.2.4 PPO的多巴活性染色

PPO活性染色的方法參照Nirmal[11]的方法略作修改。在不加熱粗酶液樣品的前提下，于4 ℃下進行Native-PAGE。電泳后，將凝膠與底物在40 ℃下孵育30 min。由于固定在凝膠上的PPO與L-Dopa反應(yīng)將產(chǎn)生黑色物質(zhì)，因此在凝膠相應(yīng)的位置上會出現(xiàn)黑色條帶。

1.2.5 PPO的肽指紋質(zhì)量圖譜分析

純化的PPO樣品進行聚丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)為7.5%的SDS-PAGE分析，用質(zhì)譜銀染法進行染色。將樣品使用胰蛋白酶酶解處理后，使用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF,AB SCIEX)進行測試分析，設(shè)置激光源為Nd:YAG 激光器(波長335 nm)，加速電壓為2 kV，掃描范圍為800～4 000 u，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。其中，一級質(zhì)譜(MS)中選擇8個信噪比大于50的母離子進行二級質(zhì)譜(MS/MS)分析，二級質(zhì)譜(MS/MS)激光累計疊加2500次。

質(zhì)譜結(jié)果用Mascot 2.2軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果，根據(jù)Mascot 2.2標(biāo)準(zhǔn)(P<0.05)對目的蛋白進行評分。

1.2.6 PPO的最適溫度和熱穩(wěn)定性

PPO最適溫度的測定在0～80 ℃下分別進行，按照節(jié)1.2.2描述的酶活力測定方法進行測定。而PPO的熱穩(wěn)定性測定，是將PPO置于0～80 ℃下(每10 ℃一個間隔)孵育30 min后，恢復(fù)至室溫，再測定酶活力。

1.2.7 PPO的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

PPO的最適pH值及pH值穩(wěn)定性的測定參照蔣經(jīng)偉等[14]的方法略作修改。最適pH值的測定方法為：在40 ℃下，于不同pH值的緩沖液中加入終濃度為15 mmol/L的L-Dopa，測定PPO在不同pH值反應(yīng)條件下的活力。pH 值穩(wěn)定性的測定方法為：將純化的酶液置于pH=3.0～9.0的一系列緩沖液中孵育30 min后，取出少量酶液置于pH=6.0的緩沖液中，測定其酶活力。

1.2.8 PPO的圓二色譜測定

將純化的PPO溶液超濾濃縮，調(diào)整其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至0.2 g/L，放入0.2 cm光徑長度的比色皿中進行圓二色譜分析。設(shè)置波長范圍為190～260 nm，步進值為1.0，帶寬為1 nm，單點掃描時間為0.5 s，溫度為20 ℃，對同一樣品重復(fù)測量3次。

1.2.9 抑制劑對PPO活性的影響

將酶液置于pH=6.0的緩沖液中，加入不同的抑制劑至相應(yīng)終濃度，在37 ℃下孵育30 min。在孵育后的體系中加入底物L(fēng)-Dopa 至終濃度為15 mmol/L，反應(yīng)30 min后，測定酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPO的分離純化

圖1為對蝦PPO分離純化的柱層析圖譜。由圖1a可知，樣品經(jīng)過DEAE-Cellulose陰離子交換柱后，去除了大量未吸附雜蛋白質(zhì)，而以L-Dopa為底物的具有活性的對應(yīng)組分被吸附。采用含0～0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L PBS (pH=7.2)對上述組分進行線性洗脫，收集活性組分并加入(NH4)2SO4固體至終濃度為1 mol/L，之后對該溶液進行Phenyl-Sepharose HP疏水柱層析。樣品經(jīng)過Phenyl-Sepharose HP柱層析的結(jié)果如圖1b所示。經(jīng)0.2 mol/L (NH4)2SO4緩沖液階段洗脫，去除了大量的未吸附雜蛋白質(zhì)。將目的蛋白用濃度為0.2～0 mol/L的(NH4)2SO4進行線性洗脫，收集活性組分進行Hi-Trap Capto-Q強陰離子交換層析。樣品經(jīng)過Hi-Trap Capto-Q層析的結(jié)果如圖1c所示，目的蛋白與雜蛋白得到了有效分離，且酶活力峰與其中一個蛋白質(zhì)峰重疊，說明該蛋白質(zhì)峰為具酶活力的主要組分。

將經(jīng)過Hi-Trap Capto-Q純化后的組分進行SDS-PAGE、Native-PAGE及多巴活性染色分析，其結(jié)果如圖2所示，可見，SDS-PAGE及Native-PAGE中均顯示單一條帶，表明本研究中的PPO得到了純化，其分子質(zhì)量約為210 ku。純化后的PPO經(jīng)活性染色處理后，對應(yīng)的條帶位置與Native-PAGE的條帶位置一致，進一步說明所得到的物質(zhì)為PPO。相比于前期對PPO的研究結(jié)果報道，本文所獲得的PPO分子質(zhì)量不同于Simpson等[7]從白對蝦(Penaeussetiferus)分離的PPO(30 ku)和Benjakul等[8]從日本對蝦(Penaeusjaponicus)中獲得的PPO(160 ku)，而與Zamorano等[9]從長額擬對蝦(Parapenaeuslongirosteis)中分離的PPO(200 ku)相似。

為了獲得PPO的一級結(jié)構(gòu)信息，對純化PPO進行質(zhì)譜分析。選擇一級質(zhì)譜結(jié)果中信噪比大于50的肽段進行MS/MS分析，二級質(zhì)譜結(jié)果如圖3所示，共得到14個肽段，含有187個氨基酸殘基(見表1)。將MS/MS分析結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進行比對發(fā)現(xiàn)，與凡納濱對蝦(L.vannamei)的酚氧化酶原(gi|147724160)的序列相似性為100%(見圖4)，進一步證明純化的酶為酚氧化酶。但是，酚氧化酶原全長僅為690個氨基酸殘基(見圖4)，推測分子質(zhì)量為78.5 ku，遠低于SDS-PAGE所顯示的210 ku(圖2)。分析原因，可能是由于PPO易生成難于被SDS化解離的多聚體而導(dǎo)致的。Zamorano等[9]利用活性染色法對長額擬對蝦PPO的研究發(fā)現(xiàn)了分子質(zhì)量為500 ku的條帶，表明PPO易形成多聚體。在本文中，僅圖2a的樣品經(jīng)非還原的SDS化，而圖2b、圖2c的樣品均未經(jīng)加熱處理，PPO仍可能以多聚體的形式存在，詳細原因有待進一步分析。

表1 二級質(zhì)譜所獲得的肽段序列

起始位點-終止位點Start-end理論分子質(zhì)量Calc.mass/u檢測分子質(zhì)量Obsrv.mass/u分子量差值Molecular weight difference/u肽段序列Peptide sequence153-1681 910.052 71 909.939 2-0.1135LIPQEQLMKAQLEVNR227-2411 884.924 81 884.929 20.0044KGELFFYMHQQMVAR262-2711 136.562 31 136.571 30.0090APIEDGYFPK280-2951 940.892 01 940.934 20.0422AWGSRQDDTVMQDFLR315-3271 562.778 41 562.783 30.0049LFDAIHQGFMIDR388-4011 528.644 01 528.639 5-0.0045EEMAVMGDTSTAMR411-4201 291.584 11 291.591 70.0076FVDDTFQEYK421-4371 976.027 01 976.021 0-0.0060LMQRPYTEQDLNLAGVK426-4591 626.762 01 626.771 60.0096NNEADVLHTGWNTR466-4771 360.715 51 360.721 70.0062GLDFNGRPVMVR516-5251 242.524 21 242.535 30.0111GQEMSFMEQR534-5471 540.859 51 540.863 80.0043FTVSLKPGSNHVVR551-5631 482.707 21 482.708 50.0013DSSITNAEELTFR639-651 1 598.742 11 598.785 20.0431YPDTRPMGFPFDR

2.2 凡納濱對蝦PPO的性質(zhì)分析

2.2.1 PPO的最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖5a可見，PPO的最適溫度為40 ℃。對PPO熱穩(wěn)定性的測量結(jié)果如圖5b所示，由圖5b可見，在0～40 ℃下，酶活力基本保持不變，當(dāng)溫度高于40 ℃時，酶活力呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，并于80 ℃時消失。PPO的最適溫度為40 ℃，與挪威海龍蝦(Nephropsnorvegicus)[6]、中國對蝦(Fenneropenouschinesis)[15]、日本對蝦的PPO最適溫度一致[17]，高于長額擬對蝦(Parapenaeuslongirosteis)[10]PPO的最適溫度(30 ℃)。在熱穩(wěn)定性方面，PPO在0～50 ℃下保持相對穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于50 ℃時，酶活力迅速下降。

2.2.2 PPO的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

由圖6a可知，PPO的最適pH值為6.0，隨著體系中pH值的下降或升高，其酶活力均呈下降趨勢。當(dāng)pH>8.0或pH<6.0時，酶活力下降十分明顯。

體系中的pH值對PPO穩(wěn)定性的影響結(jié)果如圖6b所示。在pH=5.0～8.0較為穩(wěn)定，相對活性保持在70%以上。當(dāng)pH<5.0或pH>8.0時，酶活力開始下降。

2.2.3 PPO的圓二色譜分析

圓二色譜掃描結(jié)果如圖7所示。通過軟件分析180～260 nm部分的數(shù)據(jù)，PPO的主要二級結(jié)構(gòu)為反平行β折疊和無規(guī)則卷曲。其中，反平行β折疊占33.6%，無規(guī)則卷曲占28.2%，β轉(zhuǎn)角占19.6%，α螺旋占13.6%，平行結(jié)構(gòu)占4.6%。蛋白質(zhì)分子中，α螺旋結(jié)構(gòu)、β折疊作為維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要組成部分，其在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所占比例在很大程度上影響該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。凡納濱對蝦PPO中α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)占比為47.2%，比其他能夠保持較好穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)如原肌球蛋白[16]低，因此，對應(yīng)了其對溫度、pH值較為敏感的表現(xiàn)。

2.2.4 抗壞血酸對PPO的抑制作用

不同濃度的抗壞血酸對PPO活性的抑制作用結(jié)果如圖8所示。由圖8a可以看出，隨著體系中抗壞血酸濃度的逐漸上升，PPO活力逐漸下降，當(dāng)抗壞血酸濃度達到6 mmol/L時，PPO的活力幾乎完全喪失。同樣結(jié)果也可從圖8b的活性染色中得到，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)條帶經(jīng)不同濃度的抗壞血酸孵育后，隨著濃度的上升，活性染色顯示出的條帶顏色也在逐漸消退。當(dāng)抗壞血酸濃度達到15 mmol/L時，該條帶基本消失，進一步說明抗壞血酸對PPO的活性具有抑制效果。

2.2.5 茶多酚對PPO的抑制作用

不同濃度的茶多酚對PPO活性的抑制作用結(jié)果見圖9。由圖9a可知，隨著茶多酚濃度的逐漸上升，PPO的活力逐漸下降，當(dāng)茶多酚濃度達到15 mmol/L時，PPO的活力基本喪失。圖9b的活性染色也反映了同樣的結(jié)果，當(dāng)茶多酚濃度達到16 mmol/L時，相對酶活力下降至20%，說明茶多酚對PPO的活性具有良好的抑制效果。

2.2.6 TBHQ對PPO的抑制作用

由圖10a可知，隨著TBHQ濃度的上升，PPO的相對活力逐漸下降。從圖10b的電泳分析結(jié)果也可以看出，隨著溶液中TBHQ濃度的上升，對應(yīng)條帶逐漸變淡，當(dāng)TBHQ濃度達到20 mmol/L時，該條帶基本消失。進一步說明TBHQ濃度與PPO抑制效果之間的正相關(guān)性。

阻止或延緩對蝦在冷藏過程中黑變的發(fā)生是提升其商品價值的重要手段。實際生產(chǎn)中，低溫并添加可抑制黑變的食品添加劑是主要做法。因此，本研究選擇抗壞血酸、茶多酚和TBHQ等3種常見并符合國家要求的食品添加劑對PPO的活力影響進行研究。結(jié)果表明，PPO對抗壞血酸的濃度較為敏感，6 mmol/L的抗壞血酸對PPO的活性抑制率高達91.7%，這與樊廷俊等[15]的研究結(jié)果基本一致。茶多酚對該酶的活性具有一定的抑制作用，15 mmol/L的茶多酚對PPO的活性抑制率高達94.0%。Nirmal等[12,17]的研究表明，當(dāng)兒茶酚作為PPO的抑制劑時，其反映出的混合型抑制性質(zhì)表明，其對PPO及其底物復(fù)合物均有著較強的結(jié)合作用。TBHQ對PPO的活性亦產(chǎn)生一定的抑制作用，當(dāng)TBHQ的濃度達到15 mmol/L時，其對PPO的抑制率達77%。但TBHQ是脂溶性物質(zhì)，幾乎不溶于水，影響了其在對蝦保鮮中的實際使用。最近，Sun等[18]報道了利用酸性電解水抑制對蝦黑變，其原理是酸性電解水以混合型抑制方式抑制了PPO的活性，并使PPO蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中α螺旋比例下降而無規(guī)則卷曲比例增加，從而達到破壞PPO構(gòu)象的效果。

3 結(jié)論

利用現(xiàn)代分離技術(shù)從凡納濱對蝦中分離獲得高純度PPO。PPO的分子質(zhì)量為210 ku，可能以多聚體的形式存在，其最適溫度和最適pH值分別為40 ℃和6.0。該酶的二級結(jié)構(gòu)以反平行β折疊和無規(guī)則卷曲為主，占61.8%。食品添加劑抗壞血酸、茶多酚等對其活性有良好的抑制效果。