MiR-483在人稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中表達(dá)模式

董藝超，寧安鳳，朱旗，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3. 佳木斯大學(xué)生命科學(xué)院，佳木斯 154007)

MicroRNA (miRNA) 是一類長度為18～24 nt的單鏈非編碼RNA分子，廣泛存在于各種動(dòng)植物體內(nèi)，其在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1-2]。許多研究顯示miRNAs在受精卵發(fā)育、胚胎植入和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)等生殖疾病中發(fā)揮重要作用[3-5]?；袅鳟a(chǎn)(MA) 又稱為過期流產(chǎn)或死胎不下，通常指妊娠20周之前胚胎或胎兒已經(jīng)死亡并且滯留在宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出者[6]。近年來，稽留流產(chǎn)呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢，造成稽留流產(chǎn)的原因較多，但機(jī)制尚不明確。MiR-483是一個(gè)在腫瘤發(fā)生中起重要作用的miRNA[7-8]，胚胎植入過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤與腫瘤的遷移非常相似[9]，胚胎植入失敗是引起自然流產(chǎn)的重要原因，稽留流產(chǎn)是一種特殊性的自然流產(chǎn)，但現(xiàn)階段miR-483是否與稽留流產(chǎn)相關(guān)尚不清楚。本研究通過對收集的稽留流產(chǎn)胎盤組織進(jìn)行miR-483表達(dá)模式的分析，以期為深入探究miR-483在稽留流產(chǎn)中的作用提供有價(jià)值的參考資料。

資料與方法

一、研究對象

80例稽留流產(chǎn)患者絨毛組織是從石家莊第六醫(yī)院收集，并且及1：1匹配正常人工流產(chǎn)孕婦的絨毛組織。年齡20～40歲，孕周8～12 w。排除染色體異常、感染性疾病、生殖器官異常、免疫功能障礙以及內(nèi)分泌失調(diào)等情況。依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》制定了稽留流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析兩組患者的一般資料后，未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

二、方法

1. 主要試劑：聚偏二氟乙烯(PVDF)，Bestar?SybrGreen qPCR Mastermix(DBI，德國)，地高辛雜交液以及抗體(Roche，德國)，TRIzol reagent(Invitrogen，美國)，miRNA cDNA Synthesis Kit(ABM，加拿大)，miR-483 qRT-PCR Primer Set(RIBBIO，廣州)，miR-483 地高辛探針(上海生工，上海)。

2. 總RNA的提取：取50～100 mg絨毛組織樣品，用已滅菌的剪刀將組織剪碎，加入1 ml Trizol，用勻漿器破碎至勻漿，收集上清轉(zhuǎn)入Eppdoff管，室溫靜置5 min加入0.2 ml三氯甲烷，渦旋15 s，室溫靜置30 min后，于4℃離心機(jī)中 12 000 rpm離心15 min，取上清液至新的Eppdoff管中，加入2倍上清體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜，4℃ 12 000 rpm離心10 min后棄去上清液，加入1 ml DEPC水配置的 75%乙醇，4℃ 12 000 rpm離心5 min，倒盡液體，除去管底殘液，自然干燥3 min，加入適量DEPC水溶解進(jìn)行濃度測定。

3. 定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)：取500 ng Total RNA、miRNA cDNA Synthesis Kit、miR-483 反轉(zhuǎn)錄引物、DEPC水按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μl。反應(yīng)條件：42℃ 30 min，70℃ 10 min。用反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物cDNA作為模板，依據(jù)Bestar?SybrGreen qPCR Master mix的使用說明書，選用10 μl的反應(yīng)體系，并以U6作為內(nèi)參，擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min，95℃ 10 s和 60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對表達(dá)量。每個(gè)樣品檢測三個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

4. 原位雜交：石蠟切片經(jīng)烤片脫蠟至水化后，經(jīng)0.2 mol/L的鹽酸處理后，滴加適量蛋白酶K，再用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后置于預(yù)雜交液中，42℃預(yù)雜交1 h。將地高辛標(biāo)記的miR-483探針加熱至80℃并持續(xù)10 min，將變性好的探針與與雜交液，按照1∶250的比例進(jìn)行稀釋后滴加到玻片上，40℃雜交過夜。2×SSC緩沖液洗片后，在濕盒中用封閉劑室溫孵育30 min后，加入稀釋好的抗地高辛抗體4℃孵育過夜?；謴?fù)至室溫后用NBT/BCIP顯色。顯色結(jié)束后用PBS清洗撥片，梯度脫水后用中性樹脂封片。采用地高辛標(biāo)記的LNA-scrambled探針進(jìn)行雜交來作為陰性對照

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中miR-483的總體表達(dá)模式

80例稽留流產(chǎn)和正常對照胎盤絨毛組織不分組整體分析顯示，miR-483在稽留流產(chǎn)患者胎盤組織中有上調(diào)的趨勢，但沒有顯著性差異 (圖1)。

圖1 qRT-PCR方法檢測miR-483在稽留流產(chǎn)胎盤組織中總體表達(dá)模式

2. miR-483隨年齡增長在稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中的表達(dá)變化

年齡與稽留流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，因而依據(jù)患者的年齡將其分為四組，依次為：周齡小于等于25歲(Y≤25)、26～30歲(Y 26～30)、31～35歲(Y 31～35)、大于等于36歲(Y ≥ 36)。將qRT-PCR的檢測結(jié)果按照年齡段整體分析顯示：與對照組相比，稽留流產(chǎn)患者胎盤絨毛組織中miR-483的表達(dá)在Y≤25組明顯降低(P<0.01)；在Y 26～30組顯著降低(P<0.01)；在Y 31～35組明顯上調(diào)(P<0.05)；在Y≥ 36組沒有明顯變化(圖2)。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 qRT-PCR方法檢測miR-483在不同年齡段稽留流產(chǎn)胎盤組織中總體表達(dá)模式

3.不同年齡組稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中miR-483表達(dá)量的個(gè)體化差異

對不同年齡段配對的MA組和對照組進(jìn)行miR-483表達(dá)趨勢分析，統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異的表達(dá)趨勢的陽性率。分析發(fā)現(xiàn)，在Y≤25組，miR-483的表達(dá)在100%MA患者的胎盤絨毛組織中明顯下調(diào)(P均<0.01)；在Y 26～30組，80%MA患者絨毛組織中miR-483表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05和P<0.01)；在Y 31～35組，30%MA患者絨毛組織中miR-483表達(dá)下調(diào)(P<0.05 或P<0.01)，10%MA患者絨毛組織中miR-483表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，其余MA患者miR-483的表達(dá)沒有明顯差異；在Y ≥ 36組，20%MA患者絨毛組織中miR-483表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)，20%MA患者絨毛組織中miR-483表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，其余MA患者miR-483的表達(dá)沒有明顯差異(圖3)。

4.在稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中miR-483的表達(dá)位點(diǎn)

由于Real-time 結(jié)果顯示在30歲以下MA患者胎盤絨毛組織中miR-483的表達(dá)量主要表現(xiàn)為下調(diào)，而在30歲以上的MA患者中并未呈現(xiàn)出顯著的趨勢，因此，在接下來的檢測中，將MA患者以30歲為界分成兩個(gè)組別(圖4)。原位雜交分析miR-483的表達(dá)定位結(jié)果顯示，無論在MA組還是對照組，miR-483的陽性信號主要定位于胎盤絨毛合體滋養(yǎng)層和間質(zhì)細(xì)胞。在Y≤ 30時(shí)，對照組miR-483的陽性信號強(qiáng)于MA組，在Y≥30時(shí)，對照組的miR-483陽性著色強(qiáng)度與MA組接近。

A：Y ≤25組的miR-483差異表達(dá)結(jié)果；B：Y 26～30組的miR-483差異表達(dá)結(jié)果；C：Y 31～35組的miR-483差異表達(dá)結(jié)果；D：Y ≥36組的miR-483差異表達(dá)結(jié)果；與匹配的對照組比較,**P<0.01，*P<0.05圖3 qRT-PCR方法檢測miR-483在不同年齡段稽留流產(chǎn)胎盤組織中表達(dá)的個(gè)體化差異

上圖×100，下圖×200，紅色箭頭表示miR-483陽性信號圖4 原位雜交法檢測在稽留流產(chǎn)胎盤組織中miR-483的表達(dá)位點(diǎn)

討 論

稽留流產(chǎn)作為婦產(chǎn)科的一種常見疾病發(fā)病因素很多，但確切的致病機(jī)制現(xiàn)階段尚不明確，流行病學(xué)調(diào)查研究的結(jié)果表明[10-11]，大約有2%的處于妊娠10-14周的單胎孕婦會(huì)發(fā)生稽留流產(chǎn)，且我國稽留流產(chǎn)的發(fā)生率已經(jīng)超7%，而且近年來呈現(xiàn)出逐漸上升趨勢?，F(xiàn)階段已有研究表明miR-483與胃癌、肝癌、腎上腺皮質(zhì)癌等密切相關(guān)[7，12-13]。眾所周知，胚胎植入過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤與腫瘤的遷移非常相似[9]，胚胎植入失敗會(huì)引起自然流產(chǎn)的發(fā)生，而miR-483是否與自然流產(chǎn)的一個(gè)特殊類型稽留流產(chǎn)相關(guān)尚不清楚。本研究首次報(bào)道了miR-483在稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達(dá)模式，并為了進(jìn)一步揭示miR-483與稽留流產(chǎn)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用采集的稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織，對miR-483的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)孕婦年齡在30歲以下時(shí)，miR-483表達(dá)明顯降低，而當(dāng)孕婦年齡在30歲以上時(shí)，miR-483在對照組與病理組中的表達(dá)水平并未發(fā)現(xiàn)有明顯的差異，由此可知，miR-483的表達(dá)水平在孕婦30歲前后表現(xiàn)出的差異可能與年齡的改變密切相關(guān)。而很多學(xué)者的研究顯示孕婦的年齡與各種妊娠疾病的發(fā)生高度相關(guān)[14-15]，miR-483的差異表達(dá)是否影響稽留流產(chǎn)的發(fā)生將是我們進(jìn)一步研究的方向。

MiR-483表達(dá)下調(diào)可以抑制癌癥細(xì)胞的生長和浸潤[16]，但其在胎盤組織細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。我們利用原位雜交技術(shù)定位了miR-483的結(jié)果顯示，miR-483主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中，有研究表明這兩類細(xì)胞在胎兒生長發(fā)育過程中，特別是在胎盤血管形成，以及子宮胎盤間的循環(huán)體系建立過程起到了重要作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)孕婦年齡≤30時(shí)，miR-483在稽留流產(chǎn)胎盤組織中表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)，而這一趨勢可能抑制了合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖與浸潤能力，引起胎盤發(fā)育異常，母嬰間物質(zhì)交換障礙，不利于營養(yǎng)的輸送，進(jìn)而引起胎兒發(fā)育停止，誘導(dǎo)了稽留流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述，miR-483在小于30歲稽留流產(chǎn)患者胎盤組織表達(dá)降低，其主要定位于合體滋養(yǎng)層和間質(zhì)細(xì)胞中。miR-483表達(dá)下調(diào)具體的功能以及其靶基因的相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步闡明。但相信，隨著對miR-483的分子機(jī)制和生物學(xué)功能與疾病之間的關(guān)系的進(jìn)一步研究，胎盤組織中 miR-483的表達(dá)水平對稽留流產(chǎn)早期診斷方面可能展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過對人稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中miR-483表達(dá)模式的分析，以期為今后深入研究miRNAs在稽留流產(chǎn)中的作用提供參考。

致 謝

衷心感謝石家莊市第六醫(yī)院對于組織標(biāo)本采集工作提供的支持與幫助，為本研究提供了珍貴的臨床樣本。