姜黃素對(duì)非通氣側(cè)肺損傷模型大鼠單肺通氣的改善作用研究

王小娟，王信磊

（1.中國人民解放軍第九四醫(yī)院，江西 南昌 330002； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330002）

單肺通氣是胸部手術(shù)后急性肺損傷的主要原因。研究表明，機(jī)械通氣、肺毛細(xì)血管張力衰竭、氧化應(yīng)激或缺血再灌注損傷均可引起單肺通氣肺損傷[1-3]。磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）-蛋白激酶 B（PKB，Akt）-低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）信號(hào)傳導(dǎo)通路能調(diào)控肺泡存活、阻止肺泡細(xì)胞凋亡、促進(jìn)損傷肺泡細(xì)胞再生[4]。PI3Ks不僅是Akt的激活物，還可能是Akt在胞漿中的錨定器，當(dāng)信號(hào)通路無活性時(shí)，它就將Akt固定在胞漿中，一旦有信號(hào)刺激Akt磷酸化及二聚體化，它就激活A(yù)kt，并將其轉(zhuǎn)移到胞核或其他活化位點(diǎn)，再進(jìn)一步磷酸化下游底物，進(jìn)而導(dǎo)致Akt受體通道開放時(shí)間延長，HIF-1α活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)一系列氧化損傷及免疫反應(yīng)[5-6]。姜黃素是從一些姜科、天南星科植物的根莖中提取的化學(xué)成分，有調(diào)血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用[7]。本研究中擬基于PI3K-Akt-HIF-1α信號(hào)通路探討姜黃素對(duì)非通氣側(cè)肺損傷模型大鼠單肺通氣的改善作用，為相關(guān)疾病的干預(yù)治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥與儀器

動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠100只，雌雄兼半，12周齡，體質(zhì)量（108.65±12.09）g，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20001003。動(dòng)物自由攝取飼料及飲水，自動(dòng)控制晝夜循環(huán)（12/12 h），室溫（22±1）℃。每周稱體質(zhì)量1次，每周調(diào)換籠位1次，符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

試藥：姜黃素（自行提取，每1 g提取物濃縮液相當(dāng)于生藥 10.39 g）；PI3K，Akt，HIF-1α 及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子 -α（TNF- α）、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為 KIT130974-6，KIT132087-3，KIT109759-4，KIT130854-4，KIT132058-7，KIT109793-4）均購自上海廣銳生物科技有限公司；PI3K，Akt，HIF-1α逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司；BisulFlashTMDNA甲基化修飾試劑盒（寶生物工程<大連>有限公司）。

儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；CX21型光子顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 分組、給藥與建模

將100只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照（等體積0.9%氯化鈉溶液）組、模型（等體積0.9%氯化鈉溶液）組和姜黃素高、中、低劑量（20，10，5mg/kg）組，各20只。根據(jù)成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0 mL/kg劑量灌胃，將藥液質(zhì)量濃度制備成10.0 g/mL。模型組與姜黃素高、中、低劑量組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，開始劑量為50 mg/kg，然后減少至15 mg/kg（每間隔1 h給藥1次）。行氣管切開術(shù)后，用16號(hào)導(dǎo)管插管，并在室內(nèi)空氣中以每分鐘100循環(huán)的呼吸速率維持2.5 mL潮氣量的機(jī)械通氣。在機(jī)械通氣期間施加1.5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）的呼氣末正壓。在第五肋間進(jìn)行右側(cè)胸廓切開術(shù)后，將氣管導(dǎo)管插入左主支氣管深處，并將潮氣量減少至2.0 mL。在一段特定的單肺通氣后，氣管導(dǎo)管從左主支氣管撤回到氣管，并使用10 mL注射器通過氣管導(dǎo)管將8 mL空氣注入雙肺，使右肺重新擴(kuò)張。隨后，將潮氣量增加至2.5 mL，并進(jìn)行雙肺通氣。術(shù)后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續(xù)3 d。建模成功后，各組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d。

1.3 觀察指標(biāo)測定

濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量的測定及肺損傷評(píng)分：灌胃給藥結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，取右肺組織，測定并計(jì)算濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量；隨后取右側(cè)部分肺組織進(jìn)行常規(guī)染色切片，鏡下閱片，就肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡內(nèi)充血4項(xiàng)進(jìn)行評(píng)分，無改變或改變非常輕微為0分，輕度改變?yōu)?分，中度改變?yōu)?分，重度改變?yōu)?分，極重度改變?yōu)?分，累計(jì)4項(xiàng)的總分即為肺損傷評(píng)分。

PI3K，Akt，HIF-1α mRNA 表達(dá)水平測定：采用PCR法。以Trizol法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。使用內(nèi)源性U6小核RNA（U6）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。通過 2-ΔΔCT法計(jì)算 PI3K、Akt、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物序列如下，PI3K 上游：5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，下 游 ：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′；Akt上游：5′-ATTTCACCAATCTTGTCTCCATCA-3′，下游：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′；HIF-1α 上游：5′-ATTCTACCAATCTTGTATCTACG-3′，下 游 ：5′-ATTCTGCTGTTCGACAGATTCG-3′。反應(yīng)體系，正向引物 10 μL、反向引物 10 μL、RNA 模版 0.6 μL、超級(jí)酶混合物 0.2 μL、2 × 反應(yīng)緩沖液 5 μL、去 RNA 水 3.4 μL。PCR條件，95℃持續(xù)10 min，循環(huán)40次，持續(xù)15 s，溫度60℃。

PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達(dá)水平測定：采用ELISA法。稱取大鼠右側(cè)肺組織，制成勻漿，收集上清液，按試劑盒說明書測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量比值、肺損傷評(píng)分

結(jié)果見表1。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量、肺損傷評(píng)分顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組大鼠濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量、肺損傷評(píng)分均明顯降低（P<0.05），且隨著姜黃素給藥劑量的增加，濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量、肺損傷評(píng)分逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。

表1 各組大鼠濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量、肺損傷評(píng)分比較（±s，n=20）

表1 各組大鼠濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量、肺損傷評(píng)分比較（±s，n=20）

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。下表同。

組別正常對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組劑量（mg/kg）5 10 20濕肺質(zhì)量/體質(zhì)量4.92±0.32 10.04±0.49#8.32±0.36*6.24±0.41*5.00±0.52*肺損傷評(píng)分（分）2.20±0.21 8.75±0.37#5.35±0.31*4.91±0.26*2.31±0.50*

2.2 右側(cè)肺組織HE染色

采用蘇木素-伊紅（HE）染色，結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組大鼠未見明顯肺泡破壞，無中性粒細(xì)胞浸潤，無膠原蛋白沉淀；模型組大鼠肺泡嚴(yán)重破壞，肺泡壁明顯增厚，較多膠原蛋白沉淀于肺間質(zhì)，中性粒細(xì)胞浸潤明顯；姜黃素低、中劑量組大鼠肺泡破壞程度較模型組輕，有較多中性粒細(xì)胞浸潤；姜黃素高劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，有少量中性粒細(xì)胞浸潤，幾乎無膠原蛋白沉淀。

圖1 各組大鼠右側(cè)肺組織染色比較（HE，×400）

2.3 肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表達(dá)水平

結(jié)果見表2。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中PI3K及AktmRNA表達(dá)水平顯著降低，HIF-1αmRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組大鼠肺組織中PI3K及Akt mRNA表達(dá)水平顯著升高，HIF-1α mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素給藥劑量的增加，PI3K及Akt mRNA表達(dá)水平逐漸升高，HIF-1α mRNA表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。

表2 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=20）

表2 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=20）

組別正常對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組劑量（mg/kg）5 10 20 PI3K 1.76±0.17 0.98±0.12#1.09±0.17*1.12±0.16*1.73±0.20*Akt 1.94±0.11 0.56±0.13#0.91±0.18*1.49±0.20*1.90±0.11*HIF-1α 1.13±0.21 2.18±0.19#1.87±0.18*1.52±0.09*1.16±0.19*

2.4 肺組織中 PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達(dá)水平

結(jié)果見表3。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組大鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素給藥劑量的增加，PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平逐漸升高，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達(dá)水平逐漸降低，劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。

表3 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較（±s，ng/g，n=20）

表3 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較（±s，ng/g，n=20）

組別正常對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組劑量（mg/kg）5 10 20 PI3K 183.67±15.63 71.14±16.78#103.73±13.65*123.17±99.69*181.58±13.74*Akt 145.77±6.46 67.86±6.98#89.45±6.98*120.15±10.69*139.63±12.73*HIF-1α 47.13±15.95 187.66±9.47#134.14±12.74*63.23±10.73*49.45±18.76*VEGF 78.98±16.32 326.21±19.69#201.36±15.32*136.32±18.32*81.32±24.36*IL-6 123.65±23.21 413.65±13.69#302.67±19.32*203.36±17.32*129.68±36.69*TNF-α 99.36±18.63 589.36±18.34#432.39±15.39*319.25±19.99*103.26±26.39*

3 討論

單肺通氣是胸外科手術(shù)中的常規(guī)操作，其優(yōu)化了手術(shù)的進(jìn)入?yún)^(qū)域，在手術(shù)過程中隔離保護(hù)肺部，加快了手術(shù)過程。但在單肺通氣期間，非通氣肺塌陷仍需灌注，導(dǎo)致毛細(xì)血管局部栓塞，引發(fā)氧化損傷，缺血或不通氣導(dǎo)致的氧缺乏進(jìn)一步加重肺泡細(xì)胞缺氧損傷[8-9]。在單肺通氣引發(fā)的非通氣側(cè)肺損傷中，若使用抗自由基藥物，則其非通氣側(cè)肺損傷程度明顯降低[10-11]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能明顯降低模型大鼠單肺通氣引發(fā)非通氣側(cè)肺損傷程度。

肺組織缺血引發(fā)的缺氧與海馬區(qū)域中抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)、興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)比例失調(diào)密切相關(guān)，認(rèn)知功能障礙發(fā)生過程中，神經(jīng)元去極化，鈉離子等陽離子大量內(nèi)流，導(dǎo)致海馬區(qū)域中興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（Glu）大量釋放，同時(shí) γ-氨基丁酸（GABA）比例升高，進(jìn)一步導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，形成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣離子作為第二信使，激活PI3K/Akt信號(hào)途徑[12-14]。HIF-1α是PI3K/Akt的下游調(diào)控因子，為堿性螺旋PAS結(jié)構(gòu)域蛋白的異二聚體，其水平在機(jī)體監(jiān)測到缺氧后立即升高，當(dāng)血液中氧含量恢復(fù)正常水平后，HIF-1α通過蛋白依賴性蛋白酶體途徑連續(xù)降解，因此常氧條件下HIF-1α維持在低水平[15-16]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可通過PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平。

低氧刺激導(dǎo)致HIF-1α mRNA及蛋白水平快速增加，這是氧化還原敏感穩(wěn)定的結(jié)果。在HIF-1異二聚化為HIF-1α后，進(jìn)入細(xì)胞核并在靶基因的缺氧反應(yīng)元件（HRE）處與 DNA 結(jié)合，促進(jìn) VEGF，IL-6，TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)一系列氧化損傷及免疫反應(yīng)[17-18]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能明顯降低單肺通氣引發(fā)非通氣側(cè)肺損傷程度，其機(jī)制與姜黃素降低VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，姜黃素能明顯改善非通氣側(cè)肺損傷模型大鼠單肺通氣情況，其機(jī)制與姜黃素通過PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達(dá)有關(guān)。