非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性的測定

林 宇，李增平，吳如慧，張 宇

(海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228)

非洲楝[Khayasenegalensis(Desr.) A. Juss]又稱非洲桃花心木、塞內(nèi)加楝、塞楝等，是主要的熱帶速生用材樹種,具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值。筆者在海南大學(xué)海甸校區(qū)內(nèi)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一些非洲楝的葉片發(fā)生較嚴(yán)重的葉斑病，通過鏡檢初步診斷為擬莖點(diǎn)霉屬真菌引起的葉斑病，取名為非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病。擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)的有性態(tài)為子囊菌門的間座殼屬(Diaporthe)，常引起多種植物的葉斑病，也可為害茄子果實(shí)引起褐紋病等[1]。非洲楝在我國目前已報道的病害有立枯病(RhizoctoniasolaniKühn)、 炭疽病(Colletotrichumsp. )、葉點(diǎn)霉葉斑病(Phyllostictasp.)、葉枯病(Pestalotiasp. )、葉霉病(Alternariasp.)、無根藤寄生(CassythafiliformisL.)以及褐根病(PhellinusnoxisCorner)等[2],中國真菌志——擬莖點(diǎn)霉屬中有楝擬莖點(diǎn)霉[Phomopsisabdita(Sacc.)Traverso]引起的楝樹枝枯病的記載[1]。國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見擬莖點(diǎn)霉屬真菌引起非洲楝葉斑病的報道。本研究針對其病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、致病性測定、病原鑒定和生物學(xué)特性測定，以便為該病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1供試樣本非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病病葉樣本采自海南省?？谑泻Ｄ洗髮W(xué)校園內(nèi)發(fā)病的非洲楝病樹，將發(fā)病的新鮮病葉片樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行組織分離培養(yǎng)。

1.2供試苗木致病性測定用的苗木為種植于海南大學(xué)教學(xué)基地內(nèi)種植1年的非洲楝和大葉桃花心木幼苗。

1.3供試培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基，Czapek培養(yǎng)基，參考方中達(dá)[3]《植病研究方法》配制。

1.4菌株分離將采回的新鮮病葉用清水洗凈，參照方中達(dá)[3]有關(guān)葉部病原真菌分離方法，從病健處剪取大小為5 mm×5 mm的病葉組織塊，經(jīng)表面消毒后移到PDA平板上，28 ℃的恒溫培養(yǎng)2～3 d后純化，將純化菌株編號為FZL01，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5致病性測定參照管斌等[4]的接種方法進(jìn)行接種。選取無病蟲害的待接種植物葉片，先用75%酒精噴霧消毒，待葉片干后，在同一片葉上沿中脈分別用滅菌束針間隔3cm刺出3處傷口，靠葉尖傷口接空白對照、靠葉基的2處傷口接分離菌，重復(fù)3次。用滅菌接種環(huán)挑取PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)好的FZL01菌株約1 cm大小的菌絲塊覆蓋在傷口上，對照接空白PDA培養(yǎng)基，覆蓋濕棉花，套上塑料袋進(jìn)行保濕，第2天去掉塑料袋。定期觀察接種葉片的發(fā)病情況并做記錄。

1.6病原菌鑒定

1.6.1 形態(tài)鑒定對病斑上長有小黑點(diǎn)的病葉進(jìn)行徒手切片，在顯微鏡下觀察30個分生孢子器、50個分生孢子形態(tài)特征，測量其大小。參考《植物病原真菌學(xué)》[5]《中國真菌志》[1]和中國科學(xué)院微生物研究所的“中國微生物與病毒主題數(shù)據(jù)庫”等[6-7]資料進(jìn)行種類鑒定。

1.6.2 分子鑒定使用 OMEGA Fungal DNA Kit 提取病原菌 DNA。采用通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增 rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及特異性引物 EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG) / EF1-986R (5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC)和Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC) /Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC)擴(kuò)增翻譯延伸因子和β-tubulin基因的部分序列。PCR擴(kuò)增后對其產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。使用 OMEGA Extraction Kit 試劑盒切膠回收目的片段，純化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將獲得的序列在 NCBI 上進(jìn)行比對分析，并提交序列，對測序后的 r DNA-ITS 和 EF1-α, β-tubulin序列進(jìn)行序列聯(lián)配比較、編輯。利用 MEGA 6.0 軟件用鄰接法(neighbor-joining，NJ)以Diaporthetoxicodendri,D.vaccinii等為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7生物學(xué)特性測定選長勢一致(培養(yǎng)3 d)的FZL01菌株菌落，用滅菌打孔器在其邊緣打直徑5 mm的圓形菌餅備用，除溫度外其他測定條件均在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，除碳、氮源測定外，其他條件所用培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。采用十字交叉法測量菌落直徑。設(shè)置條件：(1)在黑暗條件下分別在10，15，20，26，28，30，32，35，40 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)4次；(2)照明燈為25 w，設(shè)置3種光暗條件(24 h照明、24h黑暗、照明∶黑暗=12 h∶12 h)，每處理重復(fù)4次；(3)將濕熱滅菌后PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11共10個梯度后制平板，接入FZL01菌株菌餅，每處理重復(fù)4次；(4)可溶性淀粉、肌醇、蔗糖、甘油、D-山梨醇、甘露醇、α-乳糖、無水葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖作為Czapek培養(yǎng)基中等質(zhì)量碳源替換蔗糖，并設(shè)置不加蔗糖的Czapek培養(yǎng)基作為對照；(5)牛肉浸膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏、硝酸鈉、硝酸鉀、L-天門冬酰胺、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨、 硝酸鈣作為Czapek培養(yǎng)基等質(zhì)量氮源替換硝酸鈉，并設(shè)置不加硝酸鈉的Czapek培養(yǎng)基作為對照。每處理重復(fù)4次。

1.8數(shù)據(jù)分析測量的數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制表。

2 結(jié)果與分析

2.1非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病癥狀病害主要在冬春季發(fā)生，從葉尖和葉邊緣開始發(fā)病，呈現(xiàn)不規(guī)則形褐色病斑，病斑邊緣具明顯的褐色線紋，潮濕條件下外圍黑褐色水漬狀，病斑向葉基擴(kuò)展迅速，導(dǎo)致葉片大面積壞死后脫落，在葉正面或背面長出大量散生的黑色小點(diǎn)(分生孢子器)；干燥條件下病斑中央變灰白色，擴(kuò)展減慢(圖1)。

2.2致病性測定接種5 d后發(fā)現(xiàn)葉片開始發(fā)病，出現(xiàn)淺褐色圓斑，邊緣水漬狀，14 d后逐漸形成不規(guī)則病斑，邊緣深褐色，在病斑中央長出黑色小點(diǎn)，為該菌的分生孢子器，對照無明顯變化。后期病斑中央部位干枯，部分接種葉片脫落，同一株樹上其他葉片無變化，將患病葉片帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織分離，重新分離獲得了與FZL01相一致的菌株，表明該菌株為致病菌。

2.3病原菌形態(tài)

2.3.1 形態(tài)特征FZL01菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)3.5 d后菌絲長滿皿，生長較快，菌落白色呈絮狀，具有同心輪紋，菌絲較濃密，其背部呈現(xiàn)暗黃色。7 d后觀察菌落生長濃密，菌絲表面形成黑色墨汁狀粘液，22 d后觀察菌落顏色加深呈暗黃色，菌絲聚集形成小黑點(diǎn)，即分生孢子器。病葉上的分生孢子器黑褐色，單個散生，初埋生后突破表皮，扁球形，直徑為153.05～243.04 μm(平均195.34 μm)，高103.19～159.51μm(平均132.87 μm)；分生孢子有α、β兩型，α型分生孢子無色單胞，紡錘形，大小為(7.8～9.27) μm×(2.54～4.02) μm(平均8.40 μm× 3.49 μm)，多具2個油球；β形分生孢子，無色單胞，線形，一端微彎曲，大小為(13.45～16.63)μm×(1.36～1.93)μm(平均15.24μm×1.61μm)(圖2)。其形態(tài)特征與擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)真菌相符[2]。

圖1 非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病癥狀

2.3.2 分子鑒定經(jīng)測序，F(xiàn)ZL01菌株的rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin序列分別為543 bp(NCBI登錄號為MK050110)、334 bp(NCBI登錄號為MK054238)和491 bp(NCBI登錄號為MK079660)，分別與Diaporthemusigena序列的相似度為98%(rDNA-ITS，AB899788.1)，92%(EF1-α，KC343869.1)和98%(β-tubulin，KC344111.1)。從Gen Bank中選取含模式菌株在內(nèi)的相關(guān)菌株Diaporthemusigena，D.pascoei，D.arecae等菌株的ITS，EF1-α及β-tubulin序列，使用3種序列聯(lián)合建樹，進(jìn)行多重序列比較及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示，該菌株的r DNA-ITS，EF1-α和β-tubulin的聯(lián)合序列與Diaporthemusigena的同源性達(dá)99%，表明該菌株FZL01與Diaporthemusigena的遺傳距離最小，聚為一類(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定結(jié)果，確定引起非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病的病原菌為Diaporthemusigena[8]，屬子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼目(Sphaeriales)、間座殼屬(Diaporthe)，其無性態(tài)為半知菌類(Imperfect)、腔孢綱(Coclomycetes)、球殼孢目(Sphacropsidales)的擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)。

2.4生物學(xué)特性

2.4.1 溫度FZL01菌株在15～35 ℃均能生長，在15～28 ℃是隨著溫度升高菌落的直徑也隨著增加，然后逐漸減少，到40 ℃完全停止。菌落在28 ℃長勢最好，表明其最適生長溫度為28 ℃(圖4)。

2.4.2 光照比較3種光照條件下病菌的生長情況，完全光照和完全黑暗條件下長勢良好，菌落大小幾乎相同，無顯著性差異，但與半光半暗長勢具顯著性差導(dǎo)，表明12 h光暗交替可抑制該菌的菌絲生長(圖5)。

2.4.3 pH值在pH為3～10時病菌均能生長，最適病菌生長的是pH值為5，說明在弱酸到中性環(huán)境下有利菌絲生長，酸性或堿性過強(qiáng)都會抑制病菌的生長(圖6)。

2.4.4 碳源在碳源測定中,以蔗糖為碳源的菌落長勢最優(yōu)，以肌醇、甘露醇、甘油為碳源和未加碳源的菌落都是薄而透明，以糖類為碳源的菌落厚薄均勻長勢較好，即病原菌對糖類的利用率優(yōu)于醇類(表1)。

表1 碳源對菌絲生長的影響

2.4.5 氮源在復(fù)合氮源測定中，以大豆蛋白胨為氮源的菌落長勢最優(yōu)；單一氮源中，以硝酸鈉為氮源菌落長勢最好，但菌落厚薄有差異，有機(jī)氮菌落較厚，長勢好而硝酸鹽菌落較薄，然而硝酸鉀厚薄程度與未加氮源的對照菌落相似，近乎透明，表明硝酸鹽不易被病菌吸收利用。氮源的利用能力從強(qiáng)到弱依次為：有機(jī)氮>銨態(tài)氮>硝態(tài)氮(表2)。

表2 氮源對菌絲生長的影響

3 討 論

擬莖點(diǎn)霉屬[Phomopsis(Sacc.)Bubak]是半知菌類、腔孢綱、球殼孢目中的一個重要真菌屬，在分類上多以有性態(tài)間座殼屬(Diaporthe) 為屬名鑒定種[8]，其種類多、廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[4]。擬莖點(diǎn)霉屬也是植物的一種內(nèi)生真菌，在自然界的大部分植物體內(nèi)廣泛存在，其代謝產(chǎn)物與植物的一系列生理生化反應(yīng)都有一定的相關(guān)性。近年來隨著對擬莖點(diǎn)霉屬新種及其病害的不斷報道，擬莖點(diǎn)霉屬菌物也引起了人們越來越多的重視[5]。到2005年為止報道該屬寄主植物共74科[6]。主要有柑橘、西番蓮、草莓、楊梅、茄子、天麻、香龍血樹、青麻、田旋花以及鳳梨科、棕擱科和竹芋科等植物[9]。該屬真菌主要侵染植物的葉、枝及果，很少侵染根，且容易從傷口侵入，引起潰瘍、爛莖、根腐、果腐、葉枯、枝枯和樹皮壞死等癥狀[10]。例如由油球擬莖點(diǎn)霉[Phomopsisdiplodinoides(Sacc) Punith]和筒鳳擬莖點(diǎn)(Phomopsisspectabilis)引起鳳梨科植物葉斑病，由棕竹擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisrhapidis)引起的棕櫚科植物褐斑病[11]。對于擬莖點(diǎn)霉屬種的生物學(xué)特性研究有很多報道。本研究發(fā)現(xiàn)引起非洲楝擬莖點(diǎn)霉葉斑病的病原菌為Diaporthemusigena，光暗交替可抑制該菌的菌絲生長；溫度28℃， pH為5，氮源為大豆蛋白胨，碳源為蔗糖時菌絲生長最適，易從傷口侵入。2002 年謝玲等報道廣西芒果褐色蒂腐病菌(Phomopsismangiferae)的最適生長溫度為25 ℃；適宜生長pH為6.0[12]，2013年張居念等報道福建采后龍眼果腐病菌龍眼擬莖點(diǎn)霉(PhomopsislonganaeChi)的最適生長溫度范圍為 25 ℃，12 h光暗交替生長最佳，最適的 pH為 6[13]。2011年牛曉慶等報道油棕葉斑病菌擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis sp.)的最適生長溫度為25 ℃；最適 pH 為7.0[14]； 以葡萄糖為碳源，以蛋白胨為氮源最適合菌絲生長。與本研究的Diaporthemusigena在溫度、pH、碳源,都存在不少差異，推測可能為不同地理來源、不同寄主的同一屬真菌不同種間會存在較大差異所致[13]。另外，擬莖點(diǎn)霉屬真菌較其他種屬的真菌而言，可能對干熱生態(tài)環(huán)境有著更強(qiáng)的耐受力和適應(yīng)力，更容易在宿主植物中生長、傳播和蔓延[15]。目前對楝科植物病害的詳細(xì)研究還比較少，但是楝科植物其潛在經(jīng)濟(jì)價值需要對其發(fā)生的病蟲害等方面進(jìn)行更詳細(xì)的研究，以便在其某一種病害發(fā)生時可及時有效地進(jìn)行生產(chǎn)防治。