瀕危蘭科植物DNA的提取方法

潘英文，張 凌，王安石，李佳潼，謝添偉，陳施明，劉福秀，林明光

(海南出入境檢驗檢疫局 熱帶植物隔離檢疫中心，?？?570311)

蘭科植物極具觀賞價值，近年來其分子生物學研究越來越多。DNA的提取是基因克隆、PCR 擴增、分子雜交以及遺傳多態(tài)性分析等分子生物學研究的基礎(chǔ)。按照《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》，蘭科植物大多為瀕危植物，瀕危蘭科植物約占公約保護植物總數(shù)的90%，是進出境物種資源查驗工作的重要組成部分。由于處于非生育期的許多蘭科植物種類間形態(tài)差別很小，僅憑形態(tài)特征較難分類。目前，蘭科植物大多采用DNA條形碼方法如atpF-atpH，rbcL，rpoB，rpoC1，psbA-trnH，matK和核糖體ITS等序列來加以鑒定[1-2]。這些方法都需要獲得高質(zhì)量DNA才能進行。為了適應(yīng)相對惡劣的環(huán)境，瀕危野生蘭科植物細胞壁堅韌含有與抗逆有關(guān)的多種化合物，如多糖、脂類、多酚等次生代謝物，高質(zhì)量的基因組DNA提取相對困難，經(jīng)典的DNA提取方法有CTAB法和SDS法[3-10]。為探索簡便和高效的蘭科植物基因組DNA提取方法，筆者對應(yīng)用較廣、成本較低的CTAB法和SDS法進行適當改良，并與試劑盒法一起對瀕危蘭科植物基因組DNA進行提取，比較不同提取方法的效果及優(yōu)缺點，旨在篩選出提取蘭科植物基因組DNA的有效方法，為開展蘭科植物后續(xù)的分子生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料供試材料來自海南出入境檢驗檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心種質(zhì)資源圃保存的瀕危蘭科植物，分別是金釵石斛Dendrobiumnobile、卷萼兜蘭Paphiopedilumappletonianum、春蘭Cymbidiumgoeringiivar.goeringii、矮萬代Vandapumila、云南火焰蘭Renantheraimschootiana、小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris，選取植株葉片為材料，每植株采集2～3片葉，放入已編號的封口袋中并立即拿回實驗室放入-70 ℃冰箱內(nèi)貯存。

1.2DNA提取方法

1.2.1 改良CTAB法取新鮮葉片100 mg，置于研缽中，加入液氮，研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)至2 mL的離心管中，再加入800 μL的CTAB提取緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1EDTA，700 mmol·L-1NaCl，φ=l%β-疏基乙醇，φ=2% CTAB，pH8.0)；混勻后65 ℃水浴30～40 min，振蕩混勻2～3次，放置冷卻至室溫，加入等體積的V酚︰V氯仿︰V異戊醇=25︰24︰1振蕩混勻，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)入一新離心管，加入1/10倍體積的3 mol·L-1NaAc和等體積的無水乙醇，混勻，冰上放置10～15 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；棄上清，沉淀用φ=70%乙醇洗滌2次，加入800 μL TE溶解后，加入等體積的V酚︰V氯仿︰V異戊醇=25︰24︰1振蕩混勻，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)入一新離心管，加入等體積的V氯仿︰V異戊醇=24︰1振蕩混勻，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)入一新離心管，加入1/10倍體積的3 mol·L-1NaAc和等體積的無水乙醇混勻，冰上放置10～15 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫靜置2～3 min晾干，加入100 μL TE或ddH2O溶解，加入10 g·L-1RNase液2 μL混勻，37 ℃保溫30 min，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 改良SDS法取新鮮葉片100 mg，置于研缽中，加入液氮，研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)至2 mL的離心管中，再加入800 μL的SDS提取緩沖液(100 mmol·L-1Tris-HCl，50 mmol·L-1EDTA，500 mmol·L-1NaCl，φ=l%β-疏基乙醇，φ=3% SDS，pH8.0)；混勻后 65 ℃水浴10 min；加1/5體積的5 mol·L-1KAc于冰上放置30 min，4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min；取上清液入一新離心管，加入等體積的V酚︰V氯仿︰V異戊醇=25︰24︰1振蕩混勻，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)入一新離心管，加入等體積的V氯仿︰V異戊醇=24︰1振蕩混勻，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)入一新離心管，加入0.6倍體積的異丙醇混勻，冰上放置10～15 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；棄上清，沉淀用φ=70%乙醇洗滌2次，室溫靜置2～3 min晾干，加入100 μL TE或ddH2O溶解，加入10 g·L-1RNase液2 μL混勻，37 ℃保溫30 min，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 試劑盒法使用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒操作手冊提取DNA。

1.3DNA檢測

1.3.1 DNA濃度與純度檢測使用Thermo Nanodrop 2000核酸分析儀測定3種方法提取的DNA樣品230 ，260，280 nm處的光吸收值，根據(jù)OD260/OD280和OD260/OD230的比值確定DNA純度。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測取5 μL樣品DNA加上Loading buffer后，使用w=1%瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液中，3 V·cm-1恒壓電泳1～2 h(Power PAC3000電泳儀，BIO-RAD)。根據(jù)電泳結(jié)果檢測DNA質(zhì)量。

1.3.3 PCR擴增檢測根據(jù)第3屆條形碼國際學術(shù)大會上建議的蘭科植物DNA條形碼片段，選擇用通用引物ITS進行PCR擴增[11-12]，以上述3種方法提取的DNA 樣品為模板進行PCR反應(yīng)及電泳檢測，以檢測提取的DNA中是否有抑制PCR反應(yīng)的成分存在。PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×PrimeStar Max premix(TaKaRa), 0.4 μmol·L-1引物, 6～10 mg·L-1模板DNA, 用ddH2O補充至20 μL。反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性8 min; 94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán); 72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2000 marker (TaKaRa) 為參照，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1DNA濃度與純度檢測由表1可看出，試劑盒法提取DNA質(zhì)量最好，OD260/OD280為1.8～1.9，OD260/OD230﹥2，表示蛋白質(zhì)，RNA、鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)污染很少，DNA純度較高，但DNA濃度明顯低于其他2種方法。CTAB法提取DNA質(zhì)量較好，DNA濃度較高，OD260/OD280為1.7～1.9，說明蛋白質(zhì)及RNA污染較少，但OD260/OD230大多低于2.0，表示存在少量鹽類或有機溶劑等其他雜質(zhì)污染。SDS法提取的DNA雖然濃度較高，但DNA質(zhì)量較差，OD260/OD280均低于1.8，OD260/OD230均低于2.0，表示DNA純度較低，存在蛋白質(zhì)、RNA、鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)污染現(xiàn)象。

表1 3種方法提取基因組DNA質(zhì)量及濃度檢測

2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量由圖1可看出，CTAB法提取的DNA電泳后樣品孔干凈，雜質(zhì)含量較低，DNA條帶清晰完整，亮度較高，有輕微拖尾現(xiàn)象；SDS法提取的DNA電泳后樣品孔殘留部分雜質(zhì)，雜質(zhì)較多，DNA條帶較模糊，亮度較低，且有較嚴重的拖尾現(xiàn)象，DNA存在降解情況；試劑盒法提取的DNA樣品孔干凈無雜質(zhì)，DNA電泳條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，但亮度較低。

A.改良CTAB法；B.改良SDS法；C.試劑盒法；1.金釵石斛；2.卷萼兜蘭；3.春蘭；4.矮萬代；5.云南火焰蘭；6.小蘭嶼蝴蝶蘭

A.改良CTAB法；B.改良SDS法；C.試劑盒法；1.金釵石斛；2.卷萼兜蘭；3.春蘭；4.矮萬代；5.云南火焰蘭；6.小蘭嶼蝴蝶蘭

2.3PCR擴增檢測DNA的提取質(zhì)量由圖2可看出，采用CTAB法和試劑盒法提取DNA作為模板進行PCR擴增反應(yīng)得到的條帶清晰，亮度較高，穩(wěn)定性好；SDS法提取DNA作為模板進行PCR擴增反應(yīng)得到的條帶亮度模糊，亮度相對較低，穩(wěn)定性大大降低；試劑盒法和CTAB法提取DNA作為模板進行PCR擴增效果均獲得理想帶型，能滿足DNA條形碼檢測鑒定的實驗要求。

3 討 論

瀕危蘭科植物大多數(shù)含有豐富的多糖多酚物質(zhì)，DNA提取過程中難于分離，尤其多糖的污染是影響植物DNA 純度的主要問題，多糖的理化性質(zhì)與DNA相似，容易與DNA 結(jié)合產(chǎn)生難溶于水的凝膠狀透明沉淀影響DNA沉淀，多糖能抑制限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶及DNA 聚合酶等酶類的生物活性，影響后續(xù)的分子生物學研究。本試驗采用SDS法提取的DNA可用于一般的PCR 反應(yīng)，只能滿足常規(guī)的分子生物學實驗要求；CTAB法和試劑盒法所提DNA質(zhì)量較高，但試劑盒法成本較高，且每次提取DNA量較少，不適用大量提取DNA，在原CTAB法基礎(chǔ)上進行改良，加入高鹽法去除雜質(zhì)，可防止沉淀過程中酚化合物氧化降解以及電離化作用，以保證提取的DNA質(zhì)量，同時通過2步沉淀法，減少蛋白質(zhì)、多糖等其它雜質(zhì)的影響，可提高DNA純度。改良CTAB法提取DNA濃度高，質(zhì)量較好，操作簡單，相比試劑盒法成本低廉。目前，有關(guān)蘭科植物DNA提取方法僅局限于春蘭、卡特蘭、石斛蘭和蕙蘭等特定的原生種或雜交種中[6-10]，主要針對蘭科特定類群的特有屬，大多數(shù)沒有涉及到多糖或多酚類物質(zhì)含量豐富的類群，改良CTAB法解決了蘭科植物DNA提取方法適用性差的問題，可廣泛應(yīng)用于蘭科植物分子生物學研究。