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    β-葡萄糖苷酶抗體的制備及比較分析

    2019-04-18 02:57:30余厚美張振文
    熱帶生物學(xué)報(bào) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:糖苷酶效價(jià)條帶

    余厚美,張振文

    (中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 儋州 571737)

    β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是一種水解酶,也叫β-D-葡萄糖苷水解酶、龍膽二糖酶[1],能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵,同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[2],相對(duì)分子質(zhì)量一般在40×103~250×103之間。1837 年, LIEBIG和 WOHLER首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶,其廣泛存在于許多古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、酵母、曲霉、昆蟲、動(dòng)物和植物中[3-5]。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量差異較大,這是由其結(jié)構(gòu)和組成的不同導(dǎo)致的。由于參與生物體的糖代謝,β-葡萄糖苷酶對(duì)維持生物體的正常生理功能有著重要作用[2],已經(jīng)在哺乳動(dòng)物的疾病防治和人類的癌癥治療方面廣泛開展了應(yīng)用研究[2,6];此外,β-葡萄糖苷酶還能將果、蔬、茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì),協(xié)助纖維素酶降解纖維素等功能[1-2,7-8],在飼料工業(yè)、生物合成和生物燃料等領(lǐng)域,β-葡萄糖苷酶同樣有巨大的應(yīng)用價(jià)值[4,9]。目前,β-葡萄糖苷酶的檢測(cè)技術(shù)主要是酶活法,主要測(cè)試方法有分光光度法、熒光法、電化法和比色法[8]和以京尼平苷為底物檢測(cè)酶活的一種新方法[10]。分光光度法容易受到干擾,靈敏度低;熒光法靈敏度高,但是操作復(fù)雜,重復(fù)性差[11]。比色法雖然靈敏度不如以京尼平苷為底物的方法高,但是總體來說,簡單、快速、重復(fù)性好[8,11]。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是免疫學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一,是將免疫學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代測(cè)試手段相結(jié)合而建立的一種超微量的檢測(cè)技術(shù)。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)成本低、可大批量檢測(cè)、專一性強(qiáng)、靈敏度高、安全性好,可進(jìn)行定性或者定量檢測(cè),不需要昂貴的儀器,操作簡單,容易推廣普及,尤其適合樣本量大、檢測(cè)種類多的現(xiàn)場(chǎng)和基層檢測(cè)[12-14]。免疫學(xué)分析技術(shù)主要利用抗原抗體的特異性結(jié)合,已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域。近年來免疫學(xué)分析技術(shù)以其抗原抗體反應(yīng)的高度專一性和特異性,在人類臨床診斷、食品安全等領(lǐng)域 廣泛應(yīng)用[15]。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料以β-葡萄糖苷酶為抗原,該抗原分別購自北京索萊寶公司、上海源葉生物公司、上海麥克林公司(表1);DMEM不完全培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司; HAT、HT、DMSO、小鼠抗體亞型鑒定試劑盒、鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)為Sigma公司產(chǎn)品;QuickAntibody-mouse 5w佐劑、clone easy培養(yǎng)基購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司;弗氏佐劑、HRP-羊抗鼠、PEG融合劑、TMB底物液、封閉液和抗體稀釋液購自海南億康生物科技有限公司;胎牛血清、小牛血清購自蘭州民海生物公司;Tween-20、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鉀和甘油等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; Babl/C小鼠購自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心;SP2/0保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心實(shí)驗(yàn)室。

    表1 不同廠家的抗原信息

    1.2動(dòng)物免疫將不同廠商生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶分別編號(hào)為A,B,C, 按每鼠50 μg的劑量與QuickAntibody-mouse 5w佐劑等劑量混勻,后腿肌肉注射免疫4只小鼠,第21 天按同樣方式再免疫 1 次,第35 天斷尾采血,全血37 ℃ 放置 2 h后4 ℃ 放置12 h,4 ℃ 10 000 r·min-1離心15 min,收集血清,每只小鼠血清都用A,B,C 3種蛋白作為包被原,ELISA間接法檢測(cè)血清效價(jià)。

    1.3單克隆抗體的制備取50 g 免疫原用生理鹽水定容到500 μL,腹腔沖擊免疫抗體效價(jià)高的小鼠,沖擊免疫后72 h 左右摘眼球取全血分離血清保存,備用。將小鼠在體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中浸泡10 min,無菌條件下取出小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞,與 SP2/0 細(xì)胞在 PEG 作用下融合,HAT 篩選培養(yǎng),培養(yǎng)7~10 d ,以免疫原為包被原,用上述間接ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清,陽性細(xì)胞用有限稀釋法克隆直至陽性單克隆率為 100%,小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備抗體,將陽性雜交瘤細(xì)胞于液氮中長期保存[13]。

    1.4腹水純化參考?xì)W文軍等方法[15]并加以改進(jìn),將新采集的腹水于4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min,去沉淀,用0.05 mol·L-1、pH7.0的PBS 5倍稀釋,在冰浴條件下等體積逐滴加入飽和硫酸銨溶液,冰浴攪拌30 min后4 ℃靜置12 h,4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min,棄上清,沉淀用與腹水等體積的0.02 mol·L-1、 pH 7.2 的PBS溶解,冰浴條件下再逐滴加入總PBS體積半量的飽和硫酸銨溶液使之達(dá)到33%飽和度,連續(xù)攪拌30 min后4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min,棄上清,沉淀用0.02 mol·L-1、pH 7.2 的PBS透析72 h后分裝,- 20 ℃凍存。每個(gè)抗體純化前后各取10 μL,用SDS-PAGE對(duì)抗體進(jìn)行電泳,考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化效果。

    1.5抗體效價(jià)和特異性檢測(cè)采用棋盤法測(cè)定抗體效價(jià),即抗原用pH 9.6,0.05 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液稀釋,按照100 ng·mL-1,200 ng·mL-1,500 ng·mL-1,1 μg·mL-1,2 μg·mL-1,5 μg·mL-1的濃度梯度包被于酶標(biāo)板,每孔100 μL,37 ℃ 包被2 h,PBST 洗滌1次,每孔用120 μL含5% 小牛血清的PBST,37 ℃封閉1.5 h,每孔加100 μL梯度稀釋的抗體,37 ℃反應(yīng)30 min,PBST洗滌 4~5 次,每孔加100 μL酶標(biāo)羊抗鼠二抗,37 ℃反應(yīng)30 min,PBST 洗滌4~5 次,TMB底物液37 ℃顯色反應(yīng)15 min,0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)后,酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測(cè)每孔的吸光度值。選擇陽性孔OD值大于陰性O(shè)D值的2.1倍的抗體最高稀釋倍數(shù)為抗體的效價(jià)。然后分別在酶標(biāo)板上包被1 μg·mL-1Aβ-葡萄糖苷酶、Bβ-葡萄糖苷酶、Cβ-葡萄糖苷酶、KLH、BSA,采用ELISA方法檢測(cè)抗體的特異性。

    1.6抗體亞型鑒定用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒檢測(cè)單抗的亞型。

    1.7電泳鑒定3種β-葡萄糖苷酶抗原分別取20 μg ABC 3種抗原,用SDS-PAGE對(duì)抗原進(jìn)行電泳,考馬斯亮藍(lán)染色。

    2 結(jié)果與分析

    2.1抗原SDS-PAGE鑒定抗原相對(duì)分子質(zhì)量大小對(duì)免疫結(jié)果至關(guān)重要。本研究將3種抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定,結(jié)果見圖1。由圖1可見,3種抗原電泳條帶差異明顯。A、B抗原在250×103附近有條帶出現(xiàn),但是出現(xiàn)位置不同,C抗原在該區(qū)域沒有條帶出現(xiàn);3個(gè)抗原在95×103附近都有條帶出現(xiàn),但是出現(xiàn)位置幾乎不重復(fù),B抗原在95×103附近只有1條帶,A、C抗原均有2條帶;B、C抗原在55×103~72×103間有1個(gè)比較粗的蛋白條帶出現(xiàn)。在所有蛋白里面, B抗原條帶最多。

    表2 小鼠血清效價(jià)檢測(cè)

    2.2小鼠血清效價(jià)檢測(cè)用免疫前的小鼠血清作為陰性對(duì)照,抗原包被5 μg·mL-1,12只小鼠血清分別梯度稀釋,得到的血清效價(jià)見表2。A免疫原免疫的小鼠只對(duì)A抗原顯色,對(duì)B,C抗原不顯色,B和C免疫的小鼠也出現(xiàn)和A抗原免疫的小鼠一樣的情況,即只對(duì)本身免疫原顯色,對(duì)其余抗原均不顯色。挑選A抗原效價(jià)高的2#小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

    2.3抗體純化前后效價(jià)測(cè)定和SDS-PAGE對(duì)比融合共鋪板8塊96孔板,融合細(xì)胞孔陽性率為1%,融合后的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過3次的有限稀釋克隆,得到5株陽性單克隆細(xì)胞。5株陽性單克隆細(xì)胞體外誘導(dǎo)法制備的腹水的效價(jià)均達(dá)到105及以上,結(jié)果見表3。純化前后進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果見圖2,純化后的抗體條帶主要集中在25×103和55×103附近,純化后雜質(zhì)明顯少于純化前,效價(jià)有所下降,但是變化不大,說明抗體純化保留了抗體的有效成分,成功去除了雜質(zhì),達(dá)到了純化的目的。

    2.4抗體純化后亞型測(cè)定和特異性測(cè)定將所有純化的抗體加入事先包被好的β-葡萄糖苷酶A 抗原、B 抗原、C 抗原、KLH、BSA板孔檢測(cè)抗體的特異性,結(jié)果(表4)表明,所有抗體均與B 抗原、C 抗原、KLH、BSA無交叉反應(yīng),說明抗體均為A 抗原特異性抗體。通過抗原抗體特異性結(jié)合把抗體固定在酶標(biāo)板上,加亞型抗體測(cè)定的單克隆抗體亞型均為IgG1型。

    表 3 腹水純化前后效價(jià)檢測(cè)

    表 4 純化后抗體特異性和抗體亞型測(cè)定

    3 討 論

    抗原抗體反應(yīng)是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)[16],抗體是免疫分析技術(shù)的核心試劑[18]。機(jī)體產(chǎn)生抗體的強(qiáng)度,受到動(dòng)物物種、年齡、體質(zhì)狀況、免疫部位、抗原結(jié)構(gòu)、抗原性質(zhì)、抗原劑量、佐劑、免疫途徑、間隔時(shí)間等因素的影響[18]。本研究使用的小鼠年齡、注射方式、注射劑量、免疫部位等完全一樣的情況下,所用的3 個(gè)β-葡萄糖苷酶均標(biāo)注來自于杏仁,分別免疫后的抗體只對(duì)相應(yīng)原免疫原顯色,對(duì)其不同來源免疫源都不顯色。即A免疫的小鼠所得血清,只對(duì)A抗原顯色,對(duì)B、C抗原均不顯色;B免疫原和C免疫原免疫動(dòng)物檢測(cè)結(jié)果A相同,都只對(duì)免疫原顯色,對(duì)其余抗原均不顯色。首先驗(yàn)證是不是抗原活性原因引起的差異,所以要求廠商分別做質(zhì)控,但是反饋質(zhì)控活性正常;又分別購買同一生產(chǎn)廠商其他貨號(hào)的產(chǎn)品,檢測(cè)所得的結(jié)果和免疫原相似,即同一廠商的不同貨號(hào)和批次的蛋白均對(duì)從該廠商采購的β-葡萄糖苷酶為免疫原免疫的鼠產(chǎn)生的抗體顯色,對(duì)其余抗體不顯色,即A免疫的小鼠所得血清,只對(duì)A廠商來源的抗原顯色,對(duì)B、C抗原均不顯色,只是不同批次和貨號(hào)間效價(jià)有差異;B和C免疫后也得到相同的結(jié)果。本研究中,3個(gè)不同來源抗原經(jīng)電泳分析表明其相對(duì)分子質(zhì)量差別較大,A和B、C抗原條帶幾乎沒有重疊,所以產(chǎn)生的抗體間無交叉反應(yīng),B、C抗原在55×103~72×103間有2個(gè)相似的條帶,但是B、C抗原免疫動(dòng)物后,抗體檢測(cè)結(jié)果表明抗原間仍然沒有交叉反應(yīng)??梢?,不同來源的抗原均產(chǎn)生了特異性抗體。β-葡萄糖苷酶免疫小鼠產(chǎn)生抗體差異如此大,可能是跟β-葡萄糖苷酶的蛋白結(jié)構(gòu)差異有關(guān),因?yàn)椴煌瑏碓?即使是同一菌屬的不同菌株或者同一植物組織)的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子質(zhì)量差異40×103~250×103的范圍[2],而且有單亞基、多亞基的區(qū)別,其結(jié)構(gòu)差異就有可能大相徑庭[19]。

    不同的結(jié)構(gòu)有不同的空間構(gòu)象,抗體的產(chǎn)生是抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng),不同構(gòu)象的抗原免疫,肯定得到不同的抗體,這也是不同廠商來源的β-葡萄糖苷酶差異巨大的原因之一。此外,有研究表明,不同來源(化學(xué)合成、不同克隆表達(dá)產(chǎn)物、自然感染表達(dá)等)的同一生物分子的抗原存在差異,抗原中單個(gè)氨基酸替代突變所致抗原性的序貫漂移和抗原不穩(wěn)定等因素都對(duì)抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生很大的影響[20]。甚至在僅有一個(gè)氨基酸差異或僅為幾個(gè)小分子DNP的情況下,也會(huì)出現(xiàn)與抗體結(jié)合的情況,使之能逃避宿主的免疫應(yīng)答、抗體效價(jià)相差巨大的情況出現(xiàn)[16,21]。為此,避免因抗原來源不同導(dǎo)致產(chǎn)生特異性抗體,開展同一來源的抗體制備是解決出現(xiàn)特異性抗體的關(guān)鍵,也是今后研究的重點(diǎn)。

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