二甲雙胍聯(lián)合COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖凋亡的影響

張永恒， 常廷民

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1.藥學(xué)部； 2.消化科，河南 衛(wèi)輝 453100

二甲雙胍是臨床上治療2型糖尿病的常用藥物，除了有降糖作用外，其還可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)卵巢癌、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤表現(xiàn)出較好的抗腫瘤作用[1-3]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是一種前列腺素過(guò)氧化物合成酶，其在乳腺癌、膠質(zhì)瘤和胰腺癌等多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-6]；已有研究[7-8]報(bào)道指出，COX-2在胃癌組織中異常高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和5年生存率等有關(guān)，抑制其表達(dá)可有效提高胃癌的治療效果。塞來(lái)昔布是一種COX-2選擇性抑制劑，因其靶向作用強(qiáng)和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)在抗腫瘤方面?zhèn)涫荜P(guān)注。近年來(lái)有研究[9]報(bào)道，二甲雙胍和塞來(lái)昔布兩藥聯(lián)用可起到協(xié)同抗胰腺癌的作用，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否有更好的抗胃癌價(jià)值尚未可知。本研究以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)二甲雙胍和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合用藥探討其抗腫瘤的分子機(jī)制，以期為胃癌的藥物治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器RPMI 1640購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，新生胎牛血清購(gòu)自杭州四季青，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)BIOBASICI公司，MTT試劑和二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司。Cyclin D1抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，PCNA抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，β-actin抗體、全蛋白抽提試劑盒、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物公司，PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)PALL公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。采用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于濕度95%、溫度37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測(cè)收集長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，制備濃度為5×105ml-1的細(xì)胞懸液，以每孔100 μl接種至96孔細(xì)胞板上，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。加入終濃度為5、10、15、20和25 mmol/L 二甲雙胍或終濃度為20、40、80、100和120 μmol/L 塞來(lái)昔布，并以不加藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照。每個(gè)處理組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT試劑20 μl作用4 h，棄培養(yǎng)液后，加入150 μl二甲基亞楓，震蕩反應(yīng)20 min。選取490 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，以酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度(OD)值。以無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白調(diào)零組，按照存活率(%)=100%×(藥物組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。每組細(xì)胞重復(fù)檢測(cè)3次。后期實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將其分為4組：對(duì)照組(未加藥)、二甲雙胍組(加入濃度為10 mmol/L二甲雙胍)、塞來(lái)昔布組(加入濃度為100 μmol/L塞來(lái)昔布)和聯(lián)合組(加入濃度為10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來(lái)昔布)，按照分組給予處理72 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞板上，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、二甲雙胍組、塞來(lái)昔布組和聯(lián)合組，按照1.3中的處理方式分別給藥作用72 h后，收集各組細(xì)胞，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，分別參照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的周期變化及凋亡率。

1.5Westernblotting檢測(cè)收集給藥作用72 h的對(duì)照組、二甲雙胍組、塞來(lái)昔布組和聯(lián)合組細(xì)胞，根據(jù)全蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，并以Braford法檢測(cè)總蛋白的濃度。將經(jīng)沸水浴處理后變性的蛋白樣品，以每孔60 μg上樣至質(zhì)量濃度為120 g/L SDS-PAGE凝膠孔中進(jìn)行電泳。待電泳分離結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)質(zhì)量濃度為50 g/L 脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h后，依次加入一抗(4 ℃，24 h)和二抗(37 ℃，1 h)孵育。待充分作用后，避光條件下加入ECL試劑顯影，最后采用圖像分析儀掃描分析。

2 結(jié)果

2.1二甲雙胍和塞來(lái)昔布單用對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響二甲雙胍和塞來(lái)昔布均能夠呈濃度-時(shí)間依賴性抑制SGC-7901細(xì)胞增殖(P<0.05)。10 mmol/L 二甲雙胍和100 μmol/L塞來(lái)昔布在72 h時(shí)，SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞存活率接近IC50值(見(jiàn)表1、表2)。故后期選用10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來(lái)昔布聯(lián)合作用72 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度的二甲雙胍對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響Tab 1 Effect of Metformin with different concentrations on the proliferation of SGC-7901 cells %

注：與0 mmol/L相比，aP<0.05。

表2 不同濃度的COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響Tab 2 Effects of different concentrations of COX-2 selective inhibitor Celecoxib on proliferation of SGC-7901 cells %

注：與0 mmol/L相比，aP<0.05。

2.2二甲雙胍和塞來(lái)昔布單用或聯(lián)合對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組相比，10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來(lái)昔布均可使SGC-7901細(xì)胞在G0/G1期所占百分比增加，S期百分比減少(P<0.05)，但二甲雙胍對(duì)G2期細(xì)胞無(wú)明顯影響(P>0.05)，而塞來(lái)昔布可使G2期細(xì)胞所占百分比降低；與二甲雙胍或塞來(lái)昔布單藥相比，兩藥聯(lián)用可增加G0/G1期細(xì)胞百分比，減少S期細(xì)胞百分比(P<0.05)。與對(duì)照組相比，二甲雙胍和塞來(lái)昔布均可使SGC-7901細(xì)胞的存活率降低(P<0.05)，兩藥聯(lián)合能夠顯著增強(qiáng)二甲雙胍或塞來(lái)昔布單藥對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 二甲雙胍和塞來(lái)昔布單用或聯(lián)合對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與二甲雙胍組相比，bP<0.05；與塞來(lái)昔布組相比，cP<0.05。

2.3二甲雙胍和塞來(lái)昔布單用或聯(lián)合對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來(lái)昔布作用48 h后，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組均明顯升高(P<0.05)，而兩藥聯(lián)用后，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率明顯高于二甲雙胍和塞來(lái)昔布的單藥作用(P<0.05，見(jiàn)圖1和表4)。

2.4二甲雙胍和塞來(lái)昔布單用或聯(lián)合對(duì)SGC-7901細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響10 mmol/L二甲雙胍和100 μmol/L塞來(lái)昔布處理SGC-7901細(xì)胞后，均能夠使細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)降低，而B(niǎo)ax表達(dá)升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥后，細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1、Bax和Bcl-2的表達(dá)變化明顯大于二甲雙胍和塞來(lái)昔布的單藥作用(P<0.05，見(jiàn)圖2、表5)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率Fig 1 The apoptosis rate of cells detected by flow cytometry in each group

組別凋亡率對(duì)照組2.37±0.12二甲雙胍組18.56±1.05a塞來(lái)昔布組22.13±2.26a聯(lián)合組29.64±2.18bcF值144.680P值0.000

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與二甲雙胍組相比，bP<0.05；與塞來(lái)昔布組相比，cP<0.05。

圖2 Western blotting 檢測(cè)各組細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)Fig 2 Expressions of PCNA, Cyclin D1, Bax and Bcl-2 proteins in each group detected by Western blotting

組別PCNACyclin D1BaxBcl-2對(duì)照組0.82±0.050.87±0.060.23±0.020.46±0.04二甲雙胍組0.52±0.03a0.63±0.05a0.32±0.03a0.24±0.03a塞來(lái)昔布組0.48±0.03a0.41±0.03a0.46±0.03a0.20±0.02a聯(lián)合組0.28±0.02bc0.25±0.03bc0.73±0.05bc0.12±0.01bcF值126.894110.380121.61784.667P值0.0000.0000.0000.000

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與二甲雙胍組相比，bP<0.05；與塞來(lái)昔布組相比，cP<0.05。

3 討論

發(fā)病率和死亡率很高的胃癌是威脅我國(guó)民眾健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前針對(duì)失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)的晚期胃癌患者，化療為主的綜合治療仍是其治療的主要方式，盡管患者的生存期有所延長(zhǎng)，但后期帶來(lái)的不良反應(yīng)也極大，尋找安全有效的治療藥物一直是胃癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。二甲雙胍是治療糖尿病的降糖藥物，塞來(lái)昔布是一種COX-2選擇性抑制劑，兩者不良反應(yīng)小，且均有較好的抗腫瘤價(jià)值。GUO等[10]研究指出，二甲雙胍可通過(guò)調(diào)控LKB1/AMPK信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；KATO等[11]通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍通過(guò)調(diào)控miRNAs來(lái)抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。WANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制NF-κB途徑誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期。CHIANG等[13]指出，COX-2在口腔癌中的過(guò)度表達(dá)增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以塞來(lái)昔布處理的移植瘤小鼠可通過(guò)阻斷波形蛋白、細(xì)胞黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子等抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移。目前，關(guān)于二甲雙胍或者塞來(lái)昔布抗胃癌的作用已得到證實(shí)，如CHEN等[14]研究指出，二甲雙胍可通過(guò)抑制HIF1α/PKM2信號(hào)通路降低胃癌細(xì)胞的存活、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯；曹宇勃等[15]指出，塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制PI3K/Akt活化，增強(qiáng)雷帕霉素抗胃癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。近年來(lái)有報(bào)道[9]指出，二甲雙胍和塞來(lái)昔布聯(lián)合用藥可起到協(xié)同抗胰腺癌細(xì)胞增殖，并激活Caspase-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，那么二甲雙胍和塞來(lái)昔布聯(lián)合是否抗胃癌效果更佳？我們以不同濃度的二甲雙胍和塞來(lái)昔布處理體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，兩者均能夠呈時(shí)間-劑量效應(yīng)抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖。以接近IC50值濃度的二甲雙胍和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h后，與二甲雙胍和塞來(lái)昔布單獨(dú)處理組相比，聯(lián)合用藥組中SGC-7901細(xì)胞的存活率明顯降低，細(xì)胞在G0/G1期所占百分比增加，S期百分比減少，并且細(xì)胞凋亡率明顯升高。提示，二甲雙胍和塞來(lái)昔布聯(lián)用可起到協(xié)同抗胃癌的作用。

二甲雙胍和塞來(lái)昔布抗腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不完全清楚。董麗儒等[16]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖核抗原PCNA和Ki-67及細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡。PATEL等[17]報(bào)道指出，二甲雙胍通過(guò)下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax表達(dá)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期和S期。同時(shí)，塞來(lái)昔布也可以通過(guò)調(diào)控PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。例如：SETIA等[18]發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布抗結(jié)腸癌的分子機(jī)制與抑制PCNA和Bcl-2表達(dá)有關(guān)；LIU等[19]指出，塞來(lái)昔布可通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Cyclin D1表達(dá)抑制鼻咽癌HONE1細(xì)胞增殖。PCNA僅表達(dá)在增殖細(xì)胞核中，可反映DNA復(fù)制的活躍程度，Cyclin D1在調(diào)控細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，細(xì)胞周期調(diào)控異常往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖的失控，PCNA和Cyclin D1常常被作為評(píng)估細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)；Bcl-2和Bax是公認(rèn)抑凋亡基因和促凋亡基因，兩者常被作為評(píng)估細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)；PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax的異常表達(dá)均與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[20-21]。為了探討二甲雙胍聯(lián)合塞來(lái)昔布抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們采用Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)的下降幅度及Bax蛋白表達(dá)的升高幅度明顯高于二甲雙胍和塞來(lái)昔布單藥處理組。提示，二甲雙胍聯(lián)合塞來(lái)昔布可通過(guò)下調(diào)PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和上調(diào)Bax表達(dá)發(fā)揮抗胃癌的作用。

綜上所述，二甲雙胍和COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布可通過(guò)下調(diào)PCNA、Cyclin D1、Bcl-2和上調(diào)Bax表達(dá)這一相同的調(diào)控機(jī)制抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩藥聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同抗腫瘤的作用，二甲雙胍和塞來(lái)昔布的聯(lián)合用藥有望成為治療胃癌的新策略。