2017年我國4個省份屠宰場豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

王長珍，劉文宇，祝 瑤，欒 天，于 淼，楊 親，劉思國，張萬江*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細(xì)菌病研究室，黑龍江 哈爾濱150069；2.哈爾濱市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，黑龍江哈爾濱150036)

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，是豬最重要的幾種細(xì)菌病病原之一。豬鏈球菌能夠引起豬的腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、多發(fā)性漿膜炎等多種疾病[1]。根據(jù)菌體莢膜抗原特性的不同，豬鏈球菌可以分為33個血清型(1-31型、34型、1/2型)，近年來報道有莢膜新型豬鏈球菌的出現(xiàn)[2]。豬鏈球菌病通常呈地方性流行，大部分病豬呈敗血性經(jīng)過，且短時間內(nèi)就會蔓延至整群[3]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。其中2型豬鏈球菌(S.suis serotype 2)感染性最強，除了感染豬，還能通過直接接觸感染人。1998年和2005年，我國江蘇省和四川省分別暴發(fā)了大規(guī)模的豬鏈球菌感染疫情，共計感染229例，死亡52例，引起了公共衛(wèi)生和科學(xué)研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。豬鏈球菌病的防控，主要通過疫苗免疫和抗生素治療，但由于豬鏈球菌血清型復(fù)雜，地區(qū)差異等原因，疫苗免疫效果往往不理想，因此抗菌藥物是目前治療豬鏈球菌病最有效的手段。然而，隨著養(yǎng)殖場抗菌藥物的大量不合理使用，豬鏈球菌耐藥性問題日益突出。為了及時監(jiān)測我國不同地區(qū)豬鏈球菌的流行情況和耐藥狀況，本研究在2017年采集我國河南、黑龍江、廣東、寧夏4個畜牧養(yǎng)殖大省大型屠宰場的豬肺臟樣品，通過細(xì)菌分離純化，共鑒定豬鏈球菌46株并確定其血清型，通過PCR技術(shù)，藥敏試驗，脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)進(jìn)一步分析，為采取有效措施應(yīng)對不同地區(qū)豬鏈球菌病提供流行病學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及病料樣品 大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213、沙門氏菌H9812均由本實驗室保存；578份健康豬肺樣品來源于2017年河南、黑龍江、廣東、寧夏4個地區(qū)屠宰場。

1.2 主要試劑 THB培養(yǎng)基購自美國BD公司；MH培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血、無菌脫纖維馬血均購自上海源葉生物科技有限公司；馬血清購自HyClone公司；15種抗生素均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；低熔點瓊脂糖(Seakem?Gold.Agarose)購自Lonza公司；SmaⅠ酶、XbaⅠ酶、TaqDNA聚合酶及蛋白酶K均購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；豬鏈球菌保守基因gdh引物[4]、豬鏈球菌血清型和莢膜新型引物[2,5]、部分耐藥基因引物[6-7]、毒力基因引物[8]參照相應(yīng)文獻(xiàn)設(shè)計，16S rRNA通用引物、optrA、lsa(E)耐藥基因引物均由本實驗室設(shè)計。所有引物由華大基因有限公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 分離菌株的培養(yǎng)及純化 利用接菌環(huán)蘸取肺臟內(nèi)切面組織直接劃線于THB血瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取可疑單菌落在添加5%馬血清的THB中37℃過夜培養(yǎng)，菌液劃線于血瓊脂平板上，如此重復(fù)直至血瓊脂平板菌落單一。參照文獻(xiàn)[4]，利用豬鏈球菌保守基因gdh引物進(jìn)行PCR初步鑒定，采用16S rRNA通用引物進(jìn)行種屬鑒定。將分離菌株保存在終濃度為25%的甘油中，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離菌株血清型及莢膜新型分型 采用文獻(xiàn)中分型方法及分型引物[2,5]，利用試劑盒提取分離菌株全基因組DNA，進(jìn)行PCR擴增，確定豬鏈球菌的血清型及新發(fā)現(xiàn)的莢膜新型血清型。

1.5 分離菌株藥物敏感性測定 參照美國CLSI推薦的方法，采用微量肉湯稀釋法對分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗，測定46株分離菌對阿奇霉素、利奈唑胺、阿莫西林、萬古霉素、青霉素、紅霉素、多西環(huán)素、利福平、大觀霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋、林可霉素、泰妙菌素、慶大霉素、恩諾沙星15種抗生素的最小抑菌濃度(MIC)，分析豬鏈球菌對15種抗生素的耐藥表型。質(zhì)控參考菌株為大腸桿菌(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC29213)。

1.6 分離菌株耐藥基因和毒力基因檢測 參考文獻(xiàn)[6-7]利用PCR方法檢測分離菌株相關(guān)耐藥基因。參照文獻(xiàn)[8]利用PCR方法檢測分離菌株epf、mrp、orf2、gapdh、sly、fbps毒力基因。

1.7 分離菌株的親緣關(guān)系分析 參照文獻(xiàn)[9]的方法，利用PFGE技術(shù)對分離的豬鏈球菌分型，并分析其親緣關(guān)系。將分離菌劃線接種于含有7%綿羊血的THA平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落于添加5%馬血清的THB中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體將其包埋在1%SKG低熔點膠中，以200 μg/mL的蛋白酶K 50℃水浴過夜，SmaⅠ30℃處理4 h～5 h；采用1%SKG低熔點膠，0.5×TBE電泳液進(jìn)行PFGE，設(shè)置電壓6 V/cm，變換角度120°，脈沖時間2.2 s～54.2 s，電泳時間18 h。采用沙門氏菌H9812作為參考株，以XbaⅠ酶切后作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖片并保存。PFGE結(jié)果利用BioNumerics7.6軟件進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株分離及鑒定結(jié)果 將采集的肺臟組織劃線接種于THB血瓊脂平板上，長蟲的菌落呈半透明或灰白，表面光滑針尖狀，有的菌落周圍出現(xiàn)β溶血環(huán)。純化后利用豬鏈球菌保守基因gdh引物進(jìn)行擴增以及通過16S rRNA進(jìn)行種屬鑒定。共鑒定豬鏈球菌46株。

2.2 分離菌株血清型及莢膜新型分型結(jié)果 利用PCR擴增豬鏈球菌不同血清型的標(biāo)志性基因。結(jié)果顯示，46株豬鏈球菌分為12種血清型和3種莢膜新型(表2)。每個地區(qū)的豬鏈球菌優(yōu)勢血清型各不同，且不同地區(qū)血清型存在多樣性。意外的是，在廣東和寧夏屠宰場的健康豬肺臟中檢出了致病力最強的2型豬鏈球菌，其次還在兩個屠宰場各分離到了4株致病力僅次于2型的9型豬鏈球菌。屠宰環(huán)節(jié)是肉制品進(jìn)入餐桌的最后一個環(huán)節(jié)，2型和9型高致病力豬鏈球菌在健康豬肺臟中的發(fā)現(xiàn)，無疑給食品安全和人的健康帶來了潛在威脅，應(yīng)該引起高度重視。

表2 豬鏈球菌血清型及莢膜新型分型Table 2 Serotype and novel capsular polysaccharide loci typing

2.3 分離菌株藥物敏感性測定結(jié)果 參照美國CLSI推薦的方法，采用微量肉湯稀釋法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗。由于美國CLSI沒有給出大觀霉素、林可霉素、泰妙菌素、慶大霉素這4種抗生素的MIC折點值，所以采用MIC50來進(jìn)行藥物敏感性統(tǒng)計。結(jié)果顯示，分離菌株對多種不同類型抗生素耐藥嚴(yán)重，耐藥譜廣，其中對紅霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素的耐藥率較高，對林可霉素，泰妙菌素的MIC50高達(dá)64μg/mL，對大觀霉素和慶大霉素MIC50分別為32 μg/mL和1 μg/mL(表3)。以上結(jié)果表明分離株整體耐藥水平較高，但所有分離株對萬古霉素均敏感。

2.4 分離菌株耐藥基因和毒力基因檢測結(jié)果 豬鏈球菌耐藥基因檢測結(jié)果顯示，分離菌株攜帶紅霉素類耐藥基因erm(B)最高達(dá)97.83%，與藥敏試驗中分離菌株對紅霉素(91.30%)和阿奇霉素(86.96%)的耐藥性相似。攜帶四環(huán)素類耐藥基因tet(O)較高達(dá)89.13%，與藥敏試驗中菌株對多西環(huán)素(80.43%)的耐藥性相似(表4)。豬鏈球菌毒力基因檢測結(jié)果顯示，毒力因子gapdh和fbps檢出率均高達(dá)100%。毒力基因orf2檢出率達(dá)95.56%，其在強弱株之間的基因序列存在差異，這種差異可能導(dǎo)致菌株致病性不同。毒力因子mrp和epf是強毒菌株標(biāo)志，分離菌株攜帶率分別為50.00%和6.52%。另外一種毒力基因sly檢出率為21.74%。表明不容忽視健康豬群中強毒菌株的存在。

表3 46株分離豬鏈球菌對常見藥物的敏感性試驗結(jié)果Table 3 The antimicrobial susceptibility rate of 46 Streptococcus suis strains

表4 46株豬鏈球菌耐藥基因統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Statistical results of S.suis resistance genes

2.5 豬鏈球菌的PFGE分型結(jié)果 利用PFGE技術(shù)對分離的豬鏈球菌進(jìn)行親緣性分析。結(jié)果顯示，同一地區(qū)分離的豬鏈球菌存在幾種相同或相似的譜型，如來自河南的菌株HN-3、HN-7、HN-8、HN-18、HN-19、HN-20有相同的PFGE譜型，表明同一地區(qū)的菌株存在克隆傳播現(xiàn)象。河南、黑龍江、廣東、寧夏4個不同地區(qū)分離的豬鏈球菌譜型總體差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但是，河南的菌株HN-4與黑龍江的菌株HLJ-3、HLJ-6、HLJ-9具有相同的譜型(圖1)，表明不同地區(qū)也有可能存在相同譜型。

3 討論

圖1 43株豬鏈球菌PFGE分型結(jié)果Fig.1 The PFGE profiles of 43S.suis strains

本研究通過對河南、黑龍江、廣東、寧夏四省市采集的578份健康豬肺臟樣品進(jìn)行分離純化，共分離豬鏈球菌46株。王松華對2011年至2015年河南及其周邊地區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖場和部分散養(yǎng)戶發(fā)病豬的肺臟進(jìn)行豬鏈球菌的分離純化，共分鑒定出72株豬鏈球菌血清2型(53.3%)，14株血清7型(10.4%)，14株血清9型(10.4%)[10]。王宇婷等人對黑龍江省在2007年～2015年接診的355頭病死豬進(jìn)行豬鏈球菌分離鑒定，其中未分出血清型的豬鏈球菌占75.6%(62/82)[11]。劉琪等人對廣東地區(qū)豬群豬鏈球菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，共檢測出19種血清型，其中主要流行的是血清2型(16.8%)[12]。本研究對分離菌分型鑒定出12種血清型和3種莢膜新型，不同地區(qū)優(yōu)勢血清型各不同，血清7型是河南分離株中的優(yōu)勢血清型，與王松華的血清2型優(yōu)勢血清型結(jié)果有所不同，原因可能是發(fā)病豬群和屠宰場健康豬群中豬鏈球菌血清型攜帶率不同，2型豬鏈球菌致病性最強，危害最大，因此在發(fā)病豬群中作為優(yōu)勢血清型的可能性較大。在黑龍江地區(qū)共分離出8株豬鏈球菌，莢膜新型占75.0%(6/8)，王宇婷等人未檢測莢膜新型，因此未分出血清型的占75.6%，這說明對黑龍江地區(qū)豬鏈球菌的防控不應(yīng)僅僅局限于以往常見的33種血清型，應(yīng)該重視莢膜新型的高分離率，對其所致疾病作出積極防控。在廣東地區(qū)分離的12株豬鏈球菌中，血清9型(33.3%)和血清12型(33.3%)為優(yōu)勢血清型，與劉琪等人的結(jié)果不同，可能由于豬鏈球菌是不可忽視的威脅豬群健康的病原菌，而廣東是畜牧業(yè)大省，發(fā)展迅速，針對以往流行且危害大的血清2型進(jìn)行疫苗免疫，加之采樣的區(qū)域性和時間性不同，結(jié)果可能會有所不同。這從另一方面也充分表明豬鏈球菌血清型復(fù)雜，即使同一地區(qū)的流行情況也需及時監(jiān)測。

進(jìn)一步采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥物敏感性試驗測定46株豬鏈球菌對臨床常用的15種抗生素的耐藥譜，這些菌株均存在廣泛耐藥，其中對紅霉素的耐藥率高達(dá)91.3%，結(jié)果與劉修權(quán)等人對北京地區(qū)4個規(guī)?；i場的豬鏈球菌對紅霉素耐藥率達(dá)92.7%相一致[13]。大環(huán)內(nèi)酯類、林克酰胺類和四環(huán)素類抗菌藥依然是臨床治療豬鏈球菌感染的常用藥物，但從藥敏結(jié)果來看，豬鏈球菌對阿奇霉素、紅霉素、林可霉素、多西環(huán)素均表現(xiàn)明顯的耐藥趨勢。作為人醫(yī)臨床治療革蘭氏陽性菌感染“最后一道防線”的藥物-萬古霉素，獸醫(yī)臨床上限制使用，本研究中所有菌株均對其敏感，與何宏魁等人的結(jié)果一致[14]。這提示應(yīng)該合理使用抗生素，建議治療時先進(jìn)行藥敏試驗來選用敏感的抗生素。利用PCR方法檢測耐藥基因，經(jīng)初步分析發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌對抗生素的耐藥性和耐藥基因有一定的關(guān)聯(lián)。但具體耐藥機制還有待進(jìn)一步研究。研究表明，豬鏈球菌致病性的強弱與毒力基因存在密切關(guān)聯(lián)[8]，本研究所檢測到的毒力基因中，sly和epf檢出率分別為21.74%和6.52%，低于王紅寶等人測定的山西省致病性豬鏈球菌毒力基因sly(72.5%)和epf(58.75%)的檢出率，這表明健康豬群和致病豬群中豬鏈球菌毒力因子有差異[15]。PFGE技術(shù)能顯示不同豬鏈球菌菌株之間復(fù)雜的基因差異，適合應(yīng)用流行病學(xué)的研究。通過PFGE技術(shù)對豬鏈球菌進(jìn)行親緣關(guān)系分析，結(jié)果顯示，不同地區(qū)分離菌株譜型差異明顯，而同一地區(qū)分離菌株譜型相似或相同，提示同一地區(qū)豬鏈球菌存在克隆傳播現(xiàn)象。相同PFGE譜型存在不同的血清型和毒力基因型，表明PFGE基因型和血清型、毒力基因型無相關(guān)性。本研究為了解我國不同地區(qū)豬鏈球菌的流行現(xiàn)狀以及防控豬鏈球菌病提供參考依據(jù)。