西南地區(qū)PRRSV分子流行病學調查及其類NADC30株基因組特征分析

周 群，周可磊，胡承哲，李 玉，任玉鵬,2，岳 華,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都610041；2.國家民族事務委員會青藏高原動物疫病防控創(chuàng)新團隊，四川成都610041)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病[1]。PRRSV基因組大小約15 kb，至少包含10個開放閱讀框(ORF)，ORF1a和ORF1b基因編碼14個非結構蛋白(Nonstructural protein，NSP)包括NSP1α、NSP1β、NSP2～NSP6、NSP7α、NSP7β、NSP8~ORF12，參與病毒基因組的轉錄和復制[2]；ORF2～ORF7編碼病毒的結構蛋白，依次編碼囊膜蛋白GP2～GP5、膜基質蛋白M和核衣殼蛋白N[3]。其中，NSP2和GP5被認為是最易變異的兩個蛋白。同時，GP5蛋白也是PRRSV誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[4]。根據(jù)基因組序列及抗原特性的差異，PRRSV被分為兩大基因型，即以LV株為代表的歐洲型(基因1型)和以VR2332株為代表的北美洲型(基因2型)[5]。

2013年，我國出現(xiàn)了在NSP2蛋白區(qū)域存在不連續(xù)的131個氨基酸缺失的類NADC30病毒株[1]。目前類NADC30病毒株已在我國大部分省份流行[6]。研究表明，2016年～2017年我國西南地區(qū)PRRSV類NADC30病毒株的流行呈上升趨勢[1,7]，但具體的流行情況和分子特征仍不明確。本研究主要通過采集2018年中國西南地區(qū)疑似PRRS患病保育豬的肺臟或血清等臨床樣本，利用RT-PCR方法對檢測到的PRRSV進行分子流行病學調查，并對中國西南地區(qū)類NADC30病毒株的基因組特征和遺傳進化規(guī)律進行研究，為更好地防控PRRS提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與主要試劑 2018年采集自我國西南地區(qū)包括四川(23/41)、重慶(6/41)、貴州(9/41)、云南(3/41)4省41個豬場共292份疑似PRRS患病保育豬的肺臟(48份)和血清(244份)樣本，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。TRIzol試劑(RNAiso Plus)、Prime-ScriptTMRT試劑盒、pMD19-T載體、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；QuickTaqHS DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒購自OMEGA公司；E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 引物設計與合成 參照文獻[3,8]中的引物序列分別合成擴增PRRSV ORF7基因的檢測引物和擴增NSP2基因的PRRSV分型引物，應用PrimerPremier5.0軟件根據(jù)類NADC30病毒株SD53-1603(MH651744.1)全基因組序列分段設計引物(表1)，用于該病毒全基因的擴增，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，并用ddH2O稀釋至10 pmol/L備用。

1.3 病料樣本、陽性樣本PRRSV分型的檢測及類NADC30病毒株基因組的擴增 取適量肺臟組織剪碎研磨、離心后，取400 μL上清用于提取核酸，血清樣本則直接取400 μL用于提取核酸。用TRIzol試劑提取上述樣本中的PRRSV總RNA，反轉錄為cDNA后于-20℃保存。以292份樣本的cDNA為模板，以ORF7 F/R為引物進行PRRSV檢測，并利用分型引物NSP2 F/R對檢測出的PRRSV進行分型。利用特異性引物(表1)對分別來自成都、宜賓、眉山、綿陽的經(jīng)NSP2引物鑒定為類NADC30病毒株的樣本cDNA進行全基因組PCR的分段擴增。PCR反應條件為94℃2 min；94℃30 s、54℃30 s、68℃1 min，35個循環(huán)；72℃8 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，對測序結果進行序列拼接，并在NCBI中對全基因組序列進行比對分析。

1.4 類NADC30病毒株全基因組特征和遺傳進化樹分析 應用MegAlign和CLC sequence Viever 8對檢測到的7株類NADC30病毒株全基因組和ORF5基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行同源性分析，并通過MEGA 7.0軟件用鄰近法構建類NADC30病毒株的全基因組及ORF5基因系統(tǒng)進化樹；應用SimPlot和RDP4軟件對7株類NADC30病毒全基因組序列進行重組分析。

2 結果與討論

2.1 病料樣品的檢測及PRRSV陽性樣本分型的結果 通過對2018年從我國西南地區(qū)采集的292份疑似PRRS的臨床樣品經(jīng)PRRSV ORF7基因的PCR檢測，結果顯示共檢出PRRSV陽性樣品129份(44.18%，95%confidence interval(CI)=38.4%～50.1%)，肺臟樣品PRRSV檢出率為44.68%(95%CI=30.2%～59.9%，21/47)，血清樣品PRRSV檢出率為44.08%(95%CI=37.8%～50.5%，108/245)。豬場PRRSV檢出率為70.73%(95%CI=54.5%～83.9%，29/41)。與近年來我國西南地區(qū)PRRSV的檢出率(22.15%～34.1%)相比明顯上升[1,7]，表明我國西南地區(qū)PRRSV的感染率呈逐年上升趨勢。利用NSP2引物對129份陽性樣本進行PCR擴增，共有64份陽性樣品擴增出了PRRSV NSP2基因(49.6%)，通過測序后分析該基因編碼蛋白的氨基酸序列可知，有45株在NSP2蛋白中存在不連續(xù)的131個氨基酸缺失的類NADC30病毒株(70.3%，95%CI=57.6%～81.1%)，8株在NSP2蛋白中存在不連續(xù)的30個氨基酸缺失的HP-PRRSV病毒株(12.5%，95%CI=5.6%～23.2%)，11株為經(jīng)典株(17.2%，95%CI=8.9%～28.7%)，65份未分型成功。有19個豬場感染的PRRSV被分型，其中14個豬場存在類NADC30病毒株感染(73.7%，95%CI=48.8%～90.9%)。與我國山東和河北等省份一致，類NADC30病毒株已經(jīng)成為我國西南地區(qū)PRRSV的優(yōu)勢流行株[9]。提示應加強對我國西南地區(qū)PRRSV類NADC30病毒株分子流行病學的監(jiān)測和對PRRS的綜合防控。

2.2 7株類NADC30病毒株基因組序列分析 對7份類NADC30病毒株樣品分段擴增，并在NCBI中對拼接后的基因組序列進行比對分析，結果顯示擴增的類NADC30病毒株基因組序列全長為14 915 bp～14 961 bp，GC含量為52.63%～52.79%，均在NSP2蛋白存在131(111aa+1aa+19aa)個氨基酸缺失。根據(jù)病毒株的采集時間和地理位置分別命名為SWU/MS2/2018、SWU/MS3/2018、SWU/MY5/2018、SWU/MY6/2018、SWU/YB1/2018、SWU/YB2/2018、SWU/CD1/2018，GenBank登錄號依次為MK429980～MK429986。病毒基因的突變和重組，對PRRS的防控造成了阻礙。在中國西南地區(qū)關于PRRSV的報道中，類NADC30病毒株與強毒株的重組事件頻繁發(fā)生[7]，但本研究中的7株PRRSV基因組經(jīng)分析均未與任何病毒株發(fā)生重組。7株PRRSV病毒基因組與30株國內(nèi)外PRRSV病毒同源性為58.7%～96.4%，與參考株中的類NADC30病毒株同源性為85.3%～96.4%，與參考株中的NADC30病毒株(JN654459.1)同源性僅93.4%～93.8%，與山東類NADC30病毒株SD53-1606(MH651745.1)的同源性為95.6%～96.4%。7株類NADC30病毒NSP2基因進化樹(圖略)、ORF5基因進化樹(圖略)和全基因組進化樹(圖1)均與類NADC30病毒株聚為一大支，并且與中國近兩年報道的山東病毒株SD53-1606和河北病毒株QHD1(MG687491.1)單獨聚為一個分支(圖1)，表明7株病毒均是由類NADC30病毒株演化而來的新病毒。其基因組與NADC30病毒株(JN654459.1)的低同源性表明，我國西南地區(qū)流行的類NADC30病毒株可能出現(xiàn)了新的變異。這提示規(guī)?；B(yǎng)殖場應更加注重生物安全，完善引種程序，避免引入新的類NADC30病毒株。

圖1 7株PRRSV類NADC30病毒株全基因組遺傳演化分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 7 PRRSV NADC30-like strains

2.3 7株類NADC30病毒株ORF5基因序列分析對7株類NADC30病毒ORF5基因的同源性分析顯示：7株病毒ORF5基因與參考株該基因核苷酸序列同源性為61.4%～97.3%，其編碼蛋白GP5的氨基酸序列與參考株該蛋白氨基酸序列同源性為53.5%～95.5%。對GP5氨基酸序列分析顯示，7株病毒中的部分病毒株GP5氨基酸序列出現(xiàn)了D54G、Y106R、K166R、V169I等突變，但7株病毒株GP5氨基酸序列中均發(fā)生了一個氨基酸(S/N33)的缺失。為進一步調查該缺失模式在PRRSV病毒株中的流行情況，將本研究中的7株病毒的ORF5基因序列與已知的395條PRRSV的ORF5基因序列比對分析，結果顯示僅有16株類NADC30病毒存在同樣的缺失模式，包括山東病毒株(10/16)、黑龍江病毒株(3/16)、廣西病毒株(1/16)、河北病毒株(1/16)、四川病毒株(1/16)。ORF5基因的遺傳進化樹顯示22株存在該缺失模式的病毒單獨聚為一個分支(圖2)。以上結果表明存在該缺失模式的病毒可能是類NADC30病毒株傳入我國后遺傳演化而來的新型病毒株，最早流行于山東地區(qū)，隨后傳入我國西南地區(qū)，目前已經(jīng)在四川地區(qū)廣泛流行[9]。關于存在該缺失模式病毒的動物試驗中，感染存在該缺失模式病毒的仔豬具有呼吸癥狀明顯，發(fā)熱程度更高、持續(xù)時間更長等臨床特征，表明存在該缺失模式的類NADC30病毒株具有較高的致病性[10]，但其具體的致病機理還有待進一步研究。

本研究調查了2018年PRRS在中國西南地區(qū)的流行情況，數(shù)據(jù)表明類NADC30病毒株為我國西南地區(qū)PRRSV的主要流行株。本研究獲得了7株PRRSV類NADC30病毒株全基因組序列，為分析該類病毒株的遺傳進化規(guī)律和變異趨勢、研發(fā)新型有效的疫苗奠定了基礎。

圖2 PRRSV ORF5基因遺傳進化樹Fig.2 Genetic phylogenetic tree of PRRSV ORF5 gene