三基因缺失重組弱毒株(PRV-HNX-TK-/gE-/gG-+PCV2 ORF2)不同途徑免疫的效果分析

吳 昊，牛偉杰，王久紅，胡耀方，姚 倫，庫(kù)旭鋼，何啟蓋*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430070；3.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢430070)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)由PR病毒(PRV)引起，主要癥狀為仔豬高熱、食欲廢絕、呼吸困難、噴嚏流涎、腹瀉、共濟(jì)失調(diào)、昏迷；母豬返情、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎；公豬則表現(xiàn)睪丸腫脹、萎縮；育肥豬則主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，15日齡內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)100%、斷奶仔豬死亡率10%～20%[1]。PRV僅有一個(gè)血清型，但是不同病毒株之間具有不同的生物學(xué)特性和毒力[2]。2013年以來(lái)，出現(xiàn)了如JS-2012株[3]、HNX株[4]、Guizhou-DY株[5]、HN12011株[6]等致病力更高的新流行株，導(dǎo)致我國(guó)PR陽(yáng)性豬場(chǎng)數(shù)及豬場(chǎng)野毒感染陽(yáng)性率大幅升高，對(duì)我國(guó)PR的防控帶來(lái)更多挑戰(zhàn)。PCV2感染目前也是臨床常見(jiàn)疾病。

使用基因缺失弱毒疫苗是PR凈化措施中的核心技術(shù)之一。當(dāng)前，肌內(nèi)注射是PR疫苗的主要免疫途徑，滴鼻免疫主要用于新生仔豬乳前免疫，但關(guān)于口服免疫PRV疫苗的研究報(bào)道不多。Maresch等探索了野豬口服免疫PR疫苗，發(fā)現(xiàn)口服免疫PRV弱毒苗能誘導(dǎo)較高的中和抗體，能保護(hù)野豬攻毒后不發(fā)生臨床癥狀[7]。但PCV2目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?？诜庖吣苡行дT導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，口服免疫方式在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)全群免疫甚至野生動(dòng)物免疫方面省時(shí)省力，還能極大地減少動(dòng)物應(yīng)激，是很有應(yīng)用價(jià)值的免疫方式[8]。

本實(shí)驗(yàn)室前期以HNX野毒株為親本病毒，將編碼2型圓環(huán)病毒(PCV2)Cap蛋白的ORF2基因插入gE/TK/gG三基因缺失弱毒株P(guān)RV-HNX-TK-/gE-/gG-[9]中，研制出PRV-PCV2重組弱毒株。本研究通過(guò)比較口服免疫與肌肉注射免疫該弱毒株的免疫效果，主要對(duì)口服免疫該弱毒株的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 PRV-HNX株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；三基因缺失重組弱毒株P(guān)RV-HNX-TK-/gE-/gG-+PCV2 ORF2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自湖北某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)，該場(chǎng)為PRV野毒陰性的養(yǎng)殖場(chǎng)，13頭28日齡的仔豬未免疫PR疫苗，母豬及仔豬(母源抗體)血清經(jīng)檢測(cè)為gB抗體陽(yáng)性，gE抗體全部為陰性。PRV-gB ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司；PCV2-dCap-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州悅洋生物技術(shù)有限公司；豬IFN-γ ELISA Kit購(gòu)自Bio-Swamp；DNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自Tiangen公司；PRV gD熒光定量PCR方法所用引物及探針由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將13頭豬隨機(jī)分成3組，口服免疫組5頭，肌注免疫組5頭，對(duì)照組3頭。

1.3 動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) 仔豬于28日齡初次免疫，56日齡加強(qiáng)免疫，免疫用缺失弱毒株濃度為5×104TCID50/mL，口服免疫組口服劑量2 mL/頭、肌注免疫組肌肉注射2 mL/頭、對(duì)照組肌肉注射2 mL DMEM培養(yǎng)基。84日齡攻毒，攻毒劑量為每頭豬口服1 mL PRV HNX株(5×106TCID50/mL)和肌注1 mL PRV HNX株(5×106TCID50/mL)，共計(jì)接種PRV HNX株(1×107TCID50)。98日齡迫殺。

分別在免疫后第0、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d，加強(qiáng)免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d；攻毒后7 d、14 d采集鼻拭子、口腔液、肛拭子、血液；記錄攻毒后1 d～14 d體溫、體重變化和臨床表現(xiàn)。攻毒后第14 d迫殺采集組織樣品，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.4 gB抗體水平檢測(cè) 采用gB-ELISA試劑盒檢測(cè)免疫后各時(shí)間點(diǎn)抗體水平。成立條件為：陰性O(shè)D值(N)-陽(yáng)性O(shè)D值(P)≥0.4，判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣品OD值(S)/陰性O(shè)D值(N)≤0.6判為陽(yáng)性；0.6

1.5 血清中和試驗(yàn)抗體的檢測(cè)(固定病毒稀釋血清法) 將50 μL不同稀釋度的免疫豬血清與50 μL 200 TCID50的PRV HNX液混合，37℃感作30 min，再加入100 μL PK-15細(xì)胞(2×105個(gè)/mL～3×105個(gè)/mL)，37℃5%CO2培養(yǎng)5 d，每d觀察CPE，采用Reed-Muench法計(jì)算出能保護(hù)50%組織培養(yǎng)細(xì)胞不出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價(jià)(PD50)。

1.6 免疫豬血清IFN-γ含量測(cè)定 采用IFN-γ ELISA試劑盒免疫前后各時(shí)間點(diǎn)血清中IFN-γ水平，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。

1.7 PCV2 Cap抗體檢測(cè) 采用PCV2-dCap-ELISA試劑盒檢測(cè)免疫前后各時(shí)間點(diǎn)PCV2 Cap抗體水平。

1.8 攻毒后臨床癥狀打分 攻毒后，每天觀察臨床癥狀30 min，觀察癥狀包括精神沉郁、食欲不振、打噴嚏、咳嗽、鼻液增多、喘氣、神經(jīng)癥狀等7個(gè)指標(biāo)，每發(fā)生一種癥狀加1分，相同癥狀不疊加[4]。

1.9 病毒載量的熒光定量PCR檢測(cè) 將攻毒前后的鼻拭子及糞拭子分別加入1 mL滅菌PBS緩沖液，震蕩5 min，8 000 r/min離心5min，取上清200 μL按照DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA以此為模板，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量PCR方法[9]檢測(cè)攻毒后PRV的病毒載量。

1.10 病理組織切片觀察 攻毒后14 d迫殺各組免疫豬，取腦、扁桃體組織(約5 mm3)，4%多聚甲醛4℃低溫固定，蠟塊包埋，切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PRV gB抗體檢測(cè)結(jié)果 免疫前各組仔豬gB抗體均為陽(yáng)性(母源抗體)，各組間S/N值無(wú)顯著差異(p>0.05)；一免后第7 d，3個(gè)組仔豬血清抗體的S/N值分別為0.169±0.033(陽(yáng)性)，0.144±0.022(陽(yáng)性)，0.757±0.009(陰性)，口服組與肌注組間無(wú)明顯差異(p>0.05)，但均極顯著的高于對(duì)照組(p<0.01)，對(duì)照組gB母源抗體消失且一直未轉(zhuǎn)陽(yáng)；二免后第14 d(42日齡)，口服組與肌注組S/N值分別為0.368±0.183(陽(yáng)性)，0.301±0.147(陽(yáng)性)，仍極顯著高于對(duì)照組0.879±0.033(陰性)(p<0.01)；二免后第28 d(56日齡)，口服組中有一頭豬gB抗體變?yōu)殛幮?.853，其平均S/N值為0.616±0.136(一頭豬轉(zhuǎn)陰)、肌注組平均S/N值為0.408±0.106(陽(yáng)性)，對(duì)照組為0.832±0.028(陰性)，口服組與對(duì)照組間無(wú)明顯差異(p>0.05)，肌注組與對(duì)照組差異顯著(0.01

2.2 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 免疫前各組豬血清中和效價(jià)均大于1∶4，且各組間無(wú)顯著差異(p>0.05)，一免第7 d后口服組與注射組仔豬中和抗體效價(jià)均開(kāi)始升高，且高于1∶4，對(duì)照組血清中和效價(jià)低于1∶4，且降至1∶2以下，口服組與注射組中和抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，且兩個(gè)免疫組間無(wú)顯著差異(p>0.05)，并持續(xù)至二免后28 d(圖2)。通過(guò)兩種免疫途徑免疫該弱毒株均能有效地誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生有效的PRV中和抗體。進(jìn)一步表明口服方式與肌肉注射均能有效地刺激仔豬產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，且免疫反應(yīng)強(qiáng)度間差異并不顯著，不過(guò)肌肉注射產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

圖1 各組豬血清中g(shù)B抗體檢測(cè)結(jié)果(N：陰性；P：陽(yáng)性)Fig.1 Results of gB antibody after immunization(N:Negative;P:Positive)

圖2 各組豬血清中和效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of serum neutralization titer after immunization

2.3 仔豬血清中IFN-γ水平測(cè)定結(jié)果 免疫前3組仔豬血清中IFN-γ含量并無(wú)顯著差異(p>0.05)；一免后第14 d口服組和肌注組的IFN-γ產(chǎn)生時(shí)間及含量水平并無(wú)顯著差異(p>0.05)，分別為382.614±25.507 pg/mL，369.525±18.932 pg/mL，極顯著高于對(duì)照組224.214±5.876 pg/mL(p<0.01)，而在二免后第7 d，口服組的IFN-γ含量(354.458±24.755 pg/mL)極顯著高于對(duì)照組(267.547±30.066 pg/mL)(p<0.01)，肌注組與對(duì)照組間差異不顯著(p>0.05)；二免后第14 d，肌注組IFN-γ含量上升(362.614±25.507 pg/mL)，與口服組(344.726±33.010 pg/mL)無(wú)顯著差異(p>0.05)，但均極顯著高于對(duì)照組(248.648±24.181 pg/mL)(p<0.01)(圖3)。通過(guò)兩種免疫途徑免疫該弱毒株均能有效地誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生IFN-γ，二免后口服組IFN-γ含量增加比肌注組更快。表明兩種方式免疫該弱毒株均能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，一免后兩種免疫方式所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)無(wú)顯著差異，值得注意的是，二免后口服方式所產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答更為迅速。

圖3 免疫后各組豬IFN-γ含量的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of IFN-γ level after immunization

2.4 免疫后血清中PCV2-Cap抗體變化 免疫前各組動(dòng)物PCV2-Cap抗體均為陽(yáng)性(母源抗體)，各組間S/P值無(wú)顯著差異；一免后第14 d，口服組仔豬血清抗體陽(yáng)性率下降至80%(4/5)，并在一免后28 d繼續(xù)下降至40%(2/5)，不過(guò)在二免后第7 d全部轉(zhuǎn)陽(yáng)，而后在二免后14 d PCV2-Cap抗體陽(yáng)性率降至60%(3/5)，并維持至二免后28 d；注射組則直到二免后14 d才降低至80%(4/5)，并持續(xù)至二免后21 d，隨后繼續(xù)下降至60%(3/5)；值得注意的是對(duì)照組的抗體陽(yáng)性率直到二免后28 d才下降至66%(2/3)(圖4)。表明該重組弱毒株并不能誘導(dǎo)具有PCV2母源抗體的保育豬產(chǎn)生針對(duì)PCV2的體液免疫應(yīng)答，反而會(huì)中和部分的PCV2母源抗體，不建議對(duì)PCV2母源抗體陽(yáng)性保育豬使用該疫苗。

2.5 免疫前后及攻毒前后各組豬體溫變化 兩種途徑免疫重組弱毒株后均未引起豬體溫升高，攻毒后第2 d，所有豬體溫均升高至41℃以上，口服組與肌注組在第5 d體溫下降至41℃以下，對(duì)照組則持續(xù)至第7 d(圖5)。免疫該重組弱毒株能夠使豬在攻毒后更快的恢復(fù)正常體溫。表明該重組弱毒株安全性良好，并且能夠縮短動(dòng)物感染PRV后高熱時(shí)長(zhǎng)，具有臨床保護(hù)力。

圖4 免疫后各組豬PCV2抗體陽(yáng)性率Fig.4 Positive rate of antibodies against PCV2

圖5 免疫前后(A)和攻毒前后(B)各組豬體溫變化Fig.5 The body temperature changes after immunization(A)and challenge(B)

2.6 攻毒后各組豬臨床表現(xiàn) 攻毒后第2 d，所有豬均出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕等癥狀，對(duì)照組豬精神濃郁、流鼻涕、呼吸困難等癥狀持續(xù)至第9 d才開(kāi)始減輕，肌注組豬第5 d開(kāi)始進(jìn)食，鼻液減少，體溫下降，少量咳嗽，口服組則在第6 d癥狀開(kāi)始減輕(圖6)。免疫該重組弱毒株能夠有效地保護(hù)動(dòng)物，減輕減少其臨床癥狀，并且能夠使其更快的恢復(fù)健康。進(jìn)一步表明該重組弱毒株能夠提供較好的臨床保護(hù)力，并且肌肉注射的免疫途徑相較于口服免疫途徑更好，不過(guò)口服途徑具有易于投服，省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)。

圖6 攻毒后各組豬臨床表現(xiàn)的打分情況Fig.6 Clinical symptoms after challenge

2.7 免疫前后及攻毒前后各組豬平均日增重 免疫后各組豬平均日增重分別為0.376±0.022 kg/d，0.384±0.024 kg/d，0.373±0.027 kg/d，3組間無(wú)顯著差異(p>0.05)；攻毒后口服組和肌注組豬日增重均顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，分別為0.360±0.122 kg/d，0.286±0.051 kg/d，-0.177±0.085 kg/d，口服組與肌注組間差異不顯著(p>0.05)(圖7)。進(jìn)一步表明該重組弱毒株安全性良好，并且能夠預(yù)防動(dòng)物感染PR后引起的消瘦癥狀，具有臨床保護(hù)力。

2.8 各組豬病毒載量的熒光定量PCR結(jié)果 攻毒前各組豬鼻、糞拭子中均未檢測(cè)到病毒拷貝，攻毒后第1 d鼻拭子中開(kāi)始有少量排毒，第3 d達(dá)到排毒高峰，口服組排毒量顯著低于對(duì)照組(0.010.05)，肌注組與對(duì)照組差異不顯著(p>0.05)；第6 d口服組豬鼻拭子中的病毒拷貝數(shù)下降至1×103.323±0.039拷貝/mL，極顯著低于對(duì)照組(1×105.079±0.247拷貝/mL)和肌注組(p<0.01)，肌注組豬的排毒量從第7 d(1×102.868±0.081拷貝/mL)開(kāi)始極顯著低于對(duì)照組(1×104.724±0.196拷貝/mL)(p<0.01)。

攻毒后第3 d口服組、肌注組和對(duì)照組豬肛拭子中病毒載量分別為1×100.516±0.101拷貝/mL，1×100.610±0.125拷貝/mL，1×101.216±0.069拷貝/mL，口服組與肌注組肛拭子中的病毒載量極顯著低于對(duì)照組(p<0.01)，3個(gè)組豬排毒高峰在攻毒后第2 d～6 d。

攻毒第12 d后口服組與注射組鼻拭子與肛拭子中僅有極少量病毒，而對(duì)照組在攻毒后第14 d仍然能從鼻拭子和肛拭子中分別檢測(cè)到1×101.212±0.164拷貝/mL和1×100.375±0.042拷貝/mL的病毒(圖8)。

以上結(jié)果顯示攻毒后，免疫組雖然不能完全阻止排毒，但是均能有效的減少排毒量和縮短排毒期。表明口服和肌肉注射兩種途徑免疫該弱毒株的免疫效果相近，均有效減少了感染豬的排毒量，降低了PRV在群間水平傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

圖7 免疫前后(A)和攻毒前后(B)各組豬的日增重Fig.7 Daily weight gain after immunization and challenge

2.9 病理切片觀察 在鏡下觀察可見(jiàn)攻毒后對(duì)照組豬腦組織中均出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)、血管袖套現(xiàn)象(血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn))、衛(wèi)星現(xiàn)象、噬神經(jīng)元現(xiàn)象等非化膿性腦炎病理變化，口服組與肌注組豬腦組織中僅出現(xiàn)少量的噬神經(jīng)元現(xiàn)象和小膠質(zhì)細(xì)胞增生；對(duì)照組扁桃體隱窩腔內(nèi)含有大量脫落的隱窩上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和炎性滲出液，口服組與肌注組豬僅見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞增生(圖9)。表明免疫該重組弱毒株能夠有效的防止病毒對(duì)組織細(xì)胞造成的病理?yè)p傷。

3 討論

口服免疫相較于常規(guī)免疫方式具有多種優(yōu)點(diǎn)：操作更方便，適用于大規(guī)模全群免疫；減少人員，節(jié)約注射器，減少豬的應(yīng)激；避免針頭重復(fù)利用帶來(lái)的交叉污染；能同時(shí)誘發(fā)粘膜免疫反應(yīng)和系統(tǒng)免疫反應(yīng)等[11]。

圖8 攻毒后各組豬的鼻拭子和肛拭子樣品中的病毒含量Fig.8 Quantification of PRV DNA load in nasal swab and rectal swab after challenge

圖9 各組豬組織病理切片結(jié)果Fig.9 Histopathological section results

本研究實(shí)驗(yàn)豬免疫三基因缺失重組弱毒株P(guān)RV-HNX-TK-/gE-/gG-+PCV2 ORF2后血清gB抗體檢測(cè)結(jié)果表明口服免疫與肌肉注射均能有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生gB抗體，結(jié)合免疫后血清對(duì)PRV HNX株的中和效價(jià)結(jié)果，表明通過(guò)口服免疫同樣能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效體液免疫反應(yīng)，但是其反應(yīng)時(shí)間較滯后。值得注意的是，第二次免疫對(duì)體液免疫水平的激發(fā)強(qiáng)度低于初次免疫，這可能是由于體內(nèi)的抗體中和了部分弱毒，導(dǎo)致實(shí)際的弱毒滴度下降。因此，在設(shè)計(jì)免疫程序的時(shí)候應(yīng)避免在抗體水平高時(shí)使用活疫苗，該結(jié)果也與譚鑫等人的研究結(jié)果相印證[12]；然而該重組弱毒株并不能有效的誘導(dǎo)具有PCV2母源抗體的保育豬產(chǎn)生高水平抗體，反而會(huì)中和部分的PCV2母源抗體。因此，不推薦在保育豬體內(nèi)具有PCV2母源抗體時(shí)使用該重組弱毒株；在細(xì)胞免疫方面，免疫后口服組與肌肉注射組IFN-γ水平均升高，但在二免后口服組細(xì)胞免疫的響應(yīng)速度與水平均高于肌肉注射組，表明口服組表現(xiàn)出了更快更強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，在使用該弱毒株對(duì)存在母源抗體的豬進(jìn)行免疫時(shí)，單純的通過(guò)體液免疫水平進(jìn)行免疫效果的評(píng)價(jià)并不全面，應(yīng)結(jié)合細(xì)胞免疫水平進(jìn)行分析。

本研究實(shí)驗(yàn)豬免疫后進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示口服與肌注兩種免疫途徑均能為豬提供一定的臨床保護(hù)力，使其更快的恢復(fù)正常體溫與日增重，而未免疫的豬均出現(xiàn)了持續(xù)咳嗽、喘氣、高溫、體重下降等臨床癥狀；病理切片結(jié)果也表明這兩種免疫方式均能阻止PRV對(duì)組織細(xì)胞造成損傷，母源抗體僅能保護(hù)豬不發(fā)生死亡，但并不能有效阻止豬出現(xiàn)臨床癥狀；兩種免疫途徑均能降低排毒量但不能完全阻止排毒，這提示在養(yǎng)殖過(guò)程中，若發(fā)生免疫豬PRV野毒抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，應(yīng)立即淘汰陽(yáng)性豬、對(duì)豬舍進(jìn)行消毒、緊急免疫未發(fā)病豬，防止豬群間交互感染。

本研究對(duì)PRV-HNX-TK-/gE-/gG-+PCV2 ORF2重組弱毒株初步嘗試經(jīng)口服途徑進(jìn)行免疫，證明了口服免疫該重組弱毒株對(duì)豬的免疫效果與肌肉注射相近，能同時(shí)誘發(fā)豬的體液免疫和細(xì)胞免疫，并且能夠?yàn)樨i提供較好的臨床保護(hù)力，不過(guò)并不能使PCV2母源抗體陽(yáng)性保育豬產(chǎn)生高水平的PCV2抗體。