豬源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌β2毒素與宿主細(xì)胞互作蛋白的篩選鑒定

曾 秀，張?zhí)m橋，周 姣，王婧祺，戴益民，張錦華*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌330045)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen，Cp)，在自然界廣泛分布，是革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢粗大桿菌。Cp是引起人類食物中毒、多種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥的重要病原微生物之一[1]。對幼年動(dòng)物影響較大，被感染的幼畜即使經(jīng)治療存活下來，也會(huì)出現(xiàn)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象[2]，對動(dòng)物的生產(chǎn)性能以及畜牧業(yè)的發(fā)展造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

根據(jù)其主要的4種致死性毒素[2](α、β、ε、ι)，Cp可分為A、B、C、D、E 5種類型，除此之外最新的分類還依據(jù)腸毒素(CPE)和壞死性腸炎毒素B(NetB)增加了F和G型[3]，其中A型和C型Cp是導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病的主要病原。Cp還產(chǎn)生β2、θ等其它外毒素和侵襲性酶，達(dá)16種以上。其中β2毒素是一種具有細(xì)胞毒性和致死性的強(qiáng)毒素[4-5]，其由CPB2基因編碼產(chǎn)生，可以由所有型Cp產(chǎn)生[6]，目前CpA的β2毒素研究較多。有研究表明β2毒素可能是α毒素的輔助毒素，β2毒素和α毒素具有協(xié)同作用[7]；也有研究表明β2毒素具有細(xì)胞毒性，可以引起豚鼠胃腸道出血壞死[4]；β2毒素在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出對人Caco-2細(xì)胞的毒性作用[6]。但是β2毒素的致病機(jī)制還不明確，其對細(xì)胞的毒性作用存在較大的爭議，且目前尚未見到與β2毒素相互作用的宿主蛋白的研究報(bào)道。因此，本研究首次采用酵母雙雜交技術(shù)，以CpA(JXJA17菌株)的β2毒素為“誘餌”蛋白，從豬腸上皮細(xì)胞系(IPEC-1)的cDNA文庫中篩選到4個(gè)與β2毒素相互作用的宿主蛋白。其中半乳糖凝集素-1(LGALS1)存在于細(xì)胞膜外側(cè)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞黏附、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用[7-8]。酵母回交驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)β2毒素和LGALS1存在特異相互作用，為進(jìn)一步探究β2毒素侵入細(xì)胞機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 CP JXJA17菌株(CP028149.1)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；IPEC-1酵母雙雜交文庫由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院教研室惠贈(zèng)；質(zhì) 粒pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、pGBKT7-Lam、pGBKT7-53、酵母菌株Y2H Gold均購自Clontech公司；PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；蛋白Marker購自Genview公司；MatchmakerTMGold酵母雙雜交系統(tǒng)購自Clontech公司；帶c-Myc標(biāo)簽的小鼠單克隆抗體(MAb)、山羊抗小鼠IgG-HRP均購自Sigma公司；化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Amersham公司。

1.2 JXJA17菌株β2毒素基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)Cp β2毒素基因序列(AJ537530.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因(798 bp)的引物(表1)，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒按照說明書提取JXJA17菌株(CP028149.1)的DNA，以其為模板，以引物BD-β2-F/和BD-β2-R(表1)PCR擴(kuò)增JXJA17菌株中的β2毒素基因，PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-β2，重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定后備用。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primes used in this study

1.3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2的構(gòu)建與鑒定 質(zhì)粒pMD18-β2經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后膠回收β2毒素基因，連接至質(zhì)粒pGBKT7中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-β2，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒pGBKT7-β2經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

1.4 含β2毒素基因誘餌蛋白的表達(dá)與鑒定 使用LiAc法制備酵母菌Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞，將測序正確的質(zhì)粒pGBKT7-β2轉(zhuǎn)化至Y2H Gold中，同時(shí)設(shè)pGBKT7轉(zhuǎn)化至Y2H Gold中為陰性對照，菌液涂布SD/-Trp固體平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d～5 d，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

將測序結(jié)果正確的pGBKT7-β2/Y2H Gold菌株培養(yǎng)至10 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 d，經(jīng)5 000 r/min離心2 min收集細(xì)菌；用0.2 mol/L NaOH抽提酵母細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂乳室溫封閉1 h，以帶cMyc標(biāo)簽的小鼠MAb(1∶5 000)為一抗4℃過夜孵育，羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，同時(shí)以pGBKT7/Y2H Gold為空白對照，經(jīng)western blot檢測β2毒素基因誘餌蛋白的表達(dá)。

1.5 誘餌蛋白β2毒素的毒性及自激活鑒定 將質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞作為陽性對照；將質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對照組；以誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2與pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，分別取每種轉(zhuǎn)化重組菌液100 μL各涂布于SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His平板，30℃培養(yǎng)3 d～5 d，觀察結(jié)果。

1.6 篩選與β2毒素相互作用的宿主蛋白 將pGBKT7-β2/Y2H Gold重組酵母菌培養(yǎng)至OD600nm=0.8時(shí)，離心棄上清，用5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸沉淀，加入1 mL IPEC-1 cDNA文庫混合，同時(shí)加入含有卡那霉素(濃度為0.1 mg/mL)的2×YPDA液體培養(yǎng)基45 mL，于30℃低速培養(yǎng)20 h以上，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)大部分細(xì)胞呈現(xiàn)“米老鼠頭”時(shí)，離心棄上清，用YPDA液體培養(yǎng)基重懸菌體，離心棄上清，用10 mL 0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸沉淀，并涂布于SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d～5 d進(jìn)行初篩。將初篩獲得的陽性菌落重新涂布至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His再次篩選，將復(fù)篩長勢良好的轉(zhuǎn)化子接種至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d～8 d后提取酵母質(zhì)粒，并將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，對測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析。

1.7 質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C的構(gòu)建 根據(jù)上述篩選并經(jīng)NCBI比對得到的與β2毒素相互作用的LGALS1蛋白基因的全長核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以IPEC-1的cDNA文庫為模板，使用引物AD-LGALS1-F/AD-LGALS1-R PCR擴(kuò)增LGALS1基因的全長；使用引物AD-LGALS1-CF/AD-LGALS1-C-R PCR擴(kuò)增LGALS1基因的C端序列。反應(yīng)程序均為98℃10 min；98℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后分別連接至pGADT7載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGADT7-LGALS1、pGADT7-LGALS1-C，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆子經(jīng)PCR鑒定后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定，鑒定正確的提取質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和質(zhì)粒pGADT7-LGALS1-C備用。

1.8 LGALS1與β2毒素相互作用的回交試驗(yàn) 將重組質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C分別轉(zhuǎn)化至1.4得到的pGBKT7-β2/Y2H Gold重組酵母菌中，并以pGADT7-T+pGBKT7-P53轉(zhuǎn)化該重組菌作為陽性對照，分別以pGADT7-T+pGBKT7-Lam轉(zhuǎn)化該重組菌以及以pGADT7-T+pGBKT7-β2轉(zhuǎn)化該重組菌作為陰性對照。分別接種至SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3 d，將培養(yǎng)后的菌液10倍倍比稀釋(100～104)后分別取10 μL各轉(zhuǎn)化重組菌的SD/-Leu/-Trp菌液依次點(diǎn)在SD/-Leu/-Trp平板上；分別取10 μL上述經(jīng)稀釋的各轉(zhuǎn)化重組菌的SD/-Leu/-Trp/-His菌液依次點(diǎn)在SD/-Leu/-Trp/-His平板上，于30℃培養(yǎng)3 d～5 d，觀察酵母菌的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2的鑒定結(jié)果 以JXJA17菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到了約800 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。測序結(jié)果顯示擴(kuò)增的β2毒素基因無堿基發(fā)生突變。誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示pGBKT7-β2經(jīng)雙酶切后在798 dp處有目的條帶(圖2)，測序結(jié)果顯示β2毒素基因無堿基突變。

圖1 β2毒素的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of β2 toxin

2.2 β2毒素蛋白的表達(dá)鑒定 將質(zhì)粒pGBKT7-β2轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H Gold內(nèi)，涂布SD/-Trp固體平板培養(yǎng)基后，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并測序鑒定，結(jié)果顯示pGBKT7-β2/Y2H Gold中含有質(zhì)粒pGBKT7-β2，且β2基因未發(fā)生堿基突變，表明pGBKT7-β2/Y2H Gold可用于后續(xù)的試驗(yàn)。采用western blot檢測β2毒素基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pGBKT7-β2/Y2H Gold重組菌可見約48 ku的目的蛋白條帶，而pGBKT7/Y2H Gold未見該蛋白條帶(圖3)，表明β2毒素在酵母菌中能正確表達(dá)，滿足后續(xù)試驗(yàn)的需要。

圖2 質(zhì)粒pGBKT7-β2雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pGBKT7-β2 plasmid by double digestion

圖3 β2毒素誘餌蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果Fig.3 Detection of the expression of bait protein β2

2.3 誘餌蛋白β2毒素的毒性和自激活鑒定結(jié)果分別將質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞作為陽性對照；將質(zhì)粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對照；以誘餌質(zhì)粒pGBKT7-β2與pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞作為試驗(yàn)組，并分別將各重組菌接種在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上(圖4C)，培養(yǎng)后觀察可見3種菌均能夠在SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上生長，且菌落大小和數(shù)量基本一致(圖4A)，表明誘餌蛋白β2毒素的表達(dá)對酵母菌無毒性。在SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上僅陽性對照能生長(圖4B)，表明誘餌蛋白β2無自激活活性。

2.4 與β2毒素互作蛋白的篩選及序列分析 將pGBKT7-β2/Y2H Gold和IPEC-1 cDNA文庫融合得到的菌液涂布于SD/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選長出的菌落接種至SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，共獲得了18個(gè)陽性克隆菌株。將得到的18個(gè)陽性克隆菌株分別提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，得到4種能與β2毒素蛋白相互作用的IPEC基因，這4種基因序列分別編碼蛋白S20、LGALS1、L12和Atrophin-1(表2)。

圖4 誘餌蛋白β2的毒性(A)和自激活(B)檢測結(jié)果Fig.4 β2 bait protein toxicity(A)and self-activating activity assay(B)

表2 與β2毒素蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白基因測序分析結(jié)果Table 2 Sequencing results of genes encoding proteins interacting with β2 toxin

2.5 質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C的構(gòu)建 以IPEC-1的cDNA文庫為模板，采用不同的引物分別擴(kuò)增LGALS1基因的全長及其C端序列。結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增得到了約400 bp和250 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖5)。分別將其與質(zhì)粒pGADT7連接轉(zhuǎn)化后測序，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物分別與LGALS1基因的全長及其C端序列完全一致，表明質(zhì)粒pGADT7-LGALS1和pGADT7-LGALS1-C構(gòu)建正確。

圖5 LGALS1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of LGALS1 gene

2.6 β2毒素與LGALS1全長及其C端相互作用的回交試驗(yàn)結(jié)果 將pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化酵母菌作為陽性對照，其在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His平板上均能生長，并且隨著菌液濃度的降低，其生長的數(shù)量減少；而pGADT7-T和pGBKT7-Lam共轉(zhuǎn)化酵母菌與pGADT7-T和pGBKT7-β2共轉(zhuǎn)化酵母菌作為陰性對照，其在SD/-Leu/-Trp平板上能生長，且隨著重組菌的濃度降低，其在SD/-Leu/-Trp平板上生長的數(shù)量減少；同時(shí)這兩組陰性對照在SD/-Leu/-Trp/-His平板上幾乎不生長。pGADT7-LGALS1和pGBKT7-β2共轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Leu/-Trp平板上能夠正常生長，但隨著重組菌的菌液濃度不斷降低，其生長的數(shù)量越來越少；該轉(zhuǎn)化菌株在SD/-Leu/-Trp/-His平板上能夠生長，但隨著菌液濃度的降低，其生長數(shù)量減少，且在菌液稀釋10倍之后就不再生長。表明β2毒素和LGALS1蛋白存在相互作用，但作用強(qiáng)度較弱。pGADT7-LGALS1-C和pGBKT7-β2共轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Leu/-Trp平板上能夠正常生長，但隨著重組菌的菌液濃度不斷降低，其生長的數(shù)量越來越少。該轉(zhuǎn)化菌株在SD/-Leu/-Trp/-His平板上能夠生長，隨著菌液濃度的降低，其在SD/-Leu/-Trp/-His平板上生長的數(shù)量減少，在菌液稀釋103倍后就不再生長，表明β2毒素與LGALS1蛋白C端能夠發(fā)生較強(qiáng)的相互作用(圖6)。上述結(jié)果表明β2毒素與LGALS1蛋白在酵母細(xì)胞中存在相互作用，但β2毒素與LGALS1蛋白C端的作用比其與LGALS1完整蛋白的作用更強(qiáng)。

圖6 β2毒素與LGALS1相互作用的回交試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Validation test of the interaction of β2 toxin with LGALS1

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是鑒定蛋白質(zhì)互作最有效和最廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)[9]，其具有操作簡單、成本低、高效、敏感度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。目前，酵母雙雜交技術(shù)也被用來探究與已知蛋白(Pik-h蛋白、剛地弓形蟲14-3-3蛋白等)相互作用的蛋白[9-10]。然而，目前未見有將酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用到篩選與Cp β2毒素相互作用的蛋白中，本研究首次將酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用到篩選與Cp β2毒素互作的宿主蛋白。Cp是一種存在于腸道內(nèi)的條件性致病菌，會(huì)造成仔豬的腹瀉、壞死性腸炎以及猝死等癥狀[3]，該菌產(chǎn)生的β2毒素對小腸粘膜上皮細(xì)胞的作用機(jī)制還不明確[5]，本研究構(gòu)建了Cp β2毒素的重組表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-β2，將其轉(zhuǎn)化至Y2H Gold后能正常表達(dá)β2毒素蛋白，且無自激活和自毒性作用。將其作為“誘餌”蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)從IPEC-1的cDNA文庫中篩選出與β2毒素相互作用的4種蛋白：S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。S20、L12和Atrophin-1屬于核蛋白，調(diào)控其它蛋白的合成[11-13]，而LGALS1蛋白與細(xì)胞的粘附、增殖和凋亡有關(guān)[7]，具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。LGALS1回交試驗(yàn)證實(shí)了LGALS1蛋白與β2毒素具有特異性的相互作用，但兩者之間相互作用強(qiáng)度較弱。有研究表明LGALS1是一種位于細(xì)胞膜中的蛋白，推測β2毒素與其的作用強(qiáng)度可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此選擇LGALS1蛋白C端與β2毒素進(jìn)行相互作用的驗(yàn)證。結(jié)果顯示β2毒素與LGALS1蛋白C端的作用強(qiáng)于其與LGALS1完整蛋白的作用。本實(shí)驗(yàn)所用的C端是從LGALS1蛋白C末端開始的66個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)片層和一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包含糖結(jié)合識別域(CRD)的大部分結(jié)構(gòu)，與完整蛋白相比該區(qū)域可能增加了β2毒素與其作用位點(diǎn)結(jié)合的概率，且重組表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)與原蛋白結(jié)構(gòu)可能略有些差異，其具體的作用位點(diǎn)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

LGALS1蛋白(半乳糖凝集素1)又稱為Galectin-1，由LGALS1基因編碼，是哺乳動(dòng)物凝集素的一種，是最先被報(bào)道的一種內(nèi)源糖結(jié)合蛋白，參與多種病理、免疫過程，具有促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)化、參與細(xì)胞粘附、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]，并且LGALS1蛋白還是NDV(新城疫病毒)HN蛋白以及VSV(水泡性口炎病毒)G蛋白的受體[14-16]，在這些病毒感染的過程中LGALS1的含量會(huì)上升，但是還未有研究表明其為細(xì)菌毒素的受體。本次研究也為研究LGALS1蛋白的功能作用提供了新的方向。

本研究采用酵母雙雜交技術(shù)篩選并鑒定出與Cp β2毒素相互作用的蛋白質(zhì)LGALS1，該蛋白主要通過C端與β2毒素結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎性因子和細(xì)胞凋亡。本研究首次將酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)用到篩選與β2毒素互作的宿主蛋白中，為β2毒素的研究提供了新方法，并為進(jìn)一步研究其細(xì)胞毒性和致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。