弓背青鳉3種雌激素受體基因的克隆及其表達(dá)分析

黃順楷，郭昱嵩，汪 淳，張海瑞，王淑如，董忠典

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江，524088）

雌激素是性類固醇激素的一員，其他還包括雄激素和孕激素[1]。雌激素在所有脊椎動(dòng)物及一些昆蟲(chóng)體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)[2-3]。動(dòng)物含有3種內(nèi)源性雌激素：雌酮(Estrone)、雌二醇(Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol)。其中，雌二醇雌激素效力最強(qiáng)，且最為普遍。除在許多器官中起調(diào)節(jié)作用外，雌激素還參與生殖細(xì)胞發(fā)生和促性腺激素調(diào)節(jié)等方面的調(diào)控[4]。雖然在雄性動(dòng)物體內(nèi)雌激素水平明顯低于雌性，但雌激素對(duì)雄性動(dòng)物也同樣具有重要生理作用[5]。

雌激素受體(Estrogen Receptor, ER)是核受體超家族的一員，具有介導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。雌激素一旦進(jìn)入細(xì)胞，很快與 ER結(jié)合，并激活 ER二聚化，使其與靶基因結(jié)合調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[6]。在大多脊椎動(dòng)物中，er家族包括2種亞型erα和erβ。在魚(yú)類中，由于特有的基因組復(fù)制事件，使得眾多的er亞型被發(fā)現(xiàn)[7-11]。一些系統(tǒng)發(fā)育上較為古老的魚(yú)類，只發(fā)現(xiàn)2種er亞型[12]。

雌激素受體功能的差異性表現(xiàn)在同一組織中er有不同表達(dá)水平。在小鼠卵泡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞增加與er表達(dá)量有關(guān)，其中erβ顯著高于erα，可能表明erβ參與顆粒細(xì)胞增殖和分化[13]。雌激素受體敲除模型構(gòu)建，為研究雌激素受體功能提供了極大便利。分別對(duì)雌性[14]和雄性[15]小鼠(Mus musculus)進(jìn)行er敲除，發(fā)現(xiàn)雌鼠不育，卵巢在排卵前停止發(fā)育；而雄鼠則出現(xiàn)睪丸萎縮等生殖能力降低現(xiàn)象。在大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)中，Chen等[16]發(fā)現(xiàn)erα和erβ2在肝中有明顯高表達(dá)，推測(cè)其在肝中起介導(dǎo)雌激素效應(yīng)作用；同時(shí)，在不同卵泡細(xì)胞、濾泡細(xì)胞和不同精子發(fā)育階段中，er各亞型有差異的表達(dá)特征，Chen等[16]認(rèn)為不同er受體類型可能在參與性腺發(fā)育和排卵過(guò)程中起不同作用。研究魚(yú)類雌激素受體功能，將有助于進(jìn)一步了解受體介導(dǎo)雌激素機(jī)制，為完善雌激素調(diào)控理論提供基礎(chǔ)。

弓背青鳉(Oryzias curvinotus)又稱海南青鳉，具有繁殖力強(qiáng)、世代周期短、廣鹽性等特點(diǎn)，具有開(kāi)發(fā)為模式生物的潛力[17]。弓背青鳉與日本青鳉(Oryzias latipes)發(fā)育非常相似，胚胎呈透明狀，且每個(gè)發(fā)育階段均有其明顯特征，在出膜前各器官已發(fā)育完全。對(duì)弓背青鳉的資源普查方面已有報(bào)道[18]，廖健等[19]以弓背青鳉作為模型，探究了魚(yú)類對(duì)壬基酚等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的響應(yīng)。

本研究克隆弓背青鳉3種ocuer亞型，并對(duì)其介導(dǎo)雌激素調(diào)控機(jī)制和參與機(jī)體功能進(jìn)行初步探究，旨在進(jìn)一步為雌激素作用機(jī)理及對(duì)生物體調(diào)節(jié)功能的研究提供基礎(chǔ)理論資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)培育、水體暴露與材料采集

實(shí)驗(yàn)用弓背青鳉 F3代為本實(shí)驗(yàn)室所繁育，親本采自廣東省湛江市高橋紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)。成魚(yú)飼養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖溫度條件為：(26 ± 2)℃，晝夜光照比為14 h∶10 h。

取性成熟雄、雌弓背青鳉各6尾，分別解剖取眼、肌肉、腦、肝臟、性腺和鰓組織，液氮速凍，用于RNA提取。

收集親本弓背青鳉所產(chǎn)的已受精魚(yú)卵，胚胎發(fā)育溫度條件為(26 ± 2) ℃，晝夜光照比為14 h∶10 h，過(guò)程中每日更換水。弓背青鳉的胚胎發(fā)育分期參考日本青鳉胚胎發(fā)育分期劃分[20]，選取胚胎發(fā)育的10個(gè)階段：1細(xì)胞期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、16肌節(jié)期、發(fā)眼期、脊索空泡化完成期、心包腔完成期、脾發(fā)育期、孵化期。每階段設(shè)置3組平行，16～20枚胚胎作為一個(gè)取樣組，用于RNA提取。

將 β-雌二醇(E2)(Macklin)溶于無(wú)水乙醇中，母液濃度為 10 mg/mL，4 ℃下保存?zhèn)溆?。取同批次出膜時(shí)間小于6 h的弓背青鳉健康仔魚(yú)576尾，進(jìn)行 E2暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為：溶劑對(duì)照組(VAbsoluteethanol∶Vwater=1∶5 000)和 E2暴露組(2 μg/L、20 μg/L、200 μg/L)。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行，每平行組 48尾仔魚(yú)，整個(gè)暴露實(shí)驗(yàn)過(guò)程不飼喂仔魚(yú)，暴露24 h后將各組存活仔魚(yú)提取RNA。

1.2 RNA提取和基因克隆

用Trizol(Invitrogen) 法提取胚胎、仔魚(yú)及成魚(yú)各組織總 RNA，并檢測(cè)其濃度和完整性。用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)合成第一鏈cDNA，所得cDNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考本實(shí)驗(yàn)室已有的弓背青鳉肝臟轉(zhuǎn)錄組中ocuer序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。以肝cDNA為模板擴(kuò)增ocuer基因片段，產(chǎn)物電泳檢測(cè)合格后純化連接到 pMD18-T(Takara)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，取陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 生物信息學(xué)分析

檢查峰型圖確定測(cè)序質(zhì)量合格，去接頭并于MEGA7.0拼接，經(jīng) BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)確定序列準(zhǔn)確后，Clustal W進(jìn)行氨基酸比對(duì)。進(jìn)一步采用鄰位連接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，各節(jié)點(diǎn)置信度采用bootst重抽樣1 000次獲得。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)克隆測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表1），檢測(cè)ocuer3種亞型在不同組織與不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，雌二醇暴露后各濃度組ocuer3種亞型表達(dá)量和ocuvtg表達(dá)量。內(nèi)參基因選擇參考Dong等[21]方法。定量 PCR儀為 LightCycler? 96 PCR system (Roche, Basel, Switzerland)，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃，5 s；60 ℃，退火 5 s；72 ℃，延伸10 s，循環(huán)數(shù)為 40。根據(jù)結(jié)果顯示的Ct值，用 2-ΔΔCt計(jì)算出ocuer的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 弓背青鳉雌激素受體基因的克隆及序列分析

本研究克隆得到弓背青鳉的3個(gè)雌激素受體亞型基因（圖1-3），分別為ocuerα、ocuerβ1、ocuerβ2。3個(gè)基因的編碼區(qū)序列長(zhǎng)分別為1 971、2 006、2 365 bp，最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(ORF)序列分別為1 860、1 689、2 007 bp，編碼的氨基酸個(gè)數(shù)相應(yīng)為619、562和688，預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量分別為67 715.32、62 321.47、73 342.92 u。

ocuErα/Erβ1/Erβ2 蛋白序列有 6 個(gè)基本功能域（圖4），分別為A/B區(qū)（轉(zhuǎn)錄激活區(qū)）、C區(qū)（DNA結(jié)合區(qū)，DBD）、D區(qū)（鉸鏈區(qū)）、E區(qū)（配體結(jié)合區(qū)，LBD）和F區(qū)。弓背青鳉3種受體的A/B區(qū)中均含MAPK激酶磷酸化位點(diǎn)（AF-1）；C區(qū)長(zhǎng)度也較一致，均含有8個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成的2個(gè)鋅指結(jié) 構(gòu) Znf1(Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys)和Znf2(Cys-X4-Cys-X9-Cys-X2-Cys)；D區(qū)含有核受體家族所保守的P-box(EGCKA)和D-box(PATNQ/A)；E區(qū)含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)AF-2(DLLLEMLDA)。

2.2 弓背青鳉雌激素受體編碼氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示 ERβ亞型聚為一類（圖5），ocuErα亞型與哺乳類、鳥(niǎo)類和兩棲類ER聚為一類；斑馬魚(yú)(Danio rario)Erγ亞型分為一支。無(wú)論是哪種亞型，弓背青鳉雌激素受體與日本青鳉和海水青鳉(Oryzias melastigma)的具有最高親緣性，與底鳉(Fundulus heteroclitus)、食蚊魚(yú)(Gambusia affinis)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)和波紋絨須石首魚(yú)(Micropogonias undulatus)的有較高親緣性。

圖1 弓背青鳉erα的cDNA序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.1 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in erα genes in Oryzias curvinotus

圖2 弓背青鳉erβ1的cDNA序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.2 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in erβ1 genes in Oryzias curvinotus

圖3 弓背青鳉erβ2的cDNA序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.3 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in erβ2 genes in Oryzias curvinotus

圖4 弓背青鳉3種雌激素受體氨基酸序列與不同物種雌激素受體序列比較Fig.4 Amino acid sequences of three ocuEr aligement with ER sequences of other species

續(xù)圖4（Continued）

2.3 弓背青鳉雌激素受體基因表達(dá)特性分析

圖6表明，ocuerα在弓背青鳉雌性的肝臟中表達(dá)量最高，但在雄性肝臟中表達(dá)量較低，雌、雄肝臟間有顯著性差異(P＜0.05)；其次在精巢和卵巢中有較高表達(dá)，在雌、雄的眼、肌肉、腦、鰓等其他組織中也有表達(dá)，但在眼、肌肉和鰓中表達(dá)量相對(duì)較低，且各組織間差異不顯著(P＞0.05)。ocuerβ1在卵巢、雄性肝臟中表達(dá)量相對(duì)較高且具有性別差異，在其他組織中也有表達(dá)，在眼、腦和雄鰓中表達(dá)量較低。ocuerβ2在青鳉的肝臟、精巢和卵巢中高表達(dá)，且肝臟中的表達(dá)量顯著高于性腺(P＜0.05)，且肝臟的表達(dá)量具有雌雄差異，其他組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，且各組織間差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 弓背青鳉與其他物種的ER氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic analysis of ER amino acid sequence with some other species by neighbor-joining

圖6 熒光定量PCR檢測(cè)弓背青鳉組織中erα、erβ1和erβ2表達(dá)量Fig.6 The expression of ocuer in various tissues of adult Oryzias curvinotus by RT-qPCR

從圖7可以看出，ocuerα在胚胎發(fā)育早期（1細(xì)胞期、卵裂期和囊胚期）表達(dá)量較低，原腸胚開(kāi)始表達(dá)量逐漸升高，在脾發(fā)育期達(dá)到最高(P＜0.05)，在器官發(fā)育階段維持一個(gè)相對(duì)較高的表達(dá)水平。在早期胚胎發(fā)育階段，ocuerβ1保持較高表達(dá)水平，在原腸胚階段出現(xiàn)峰值(P＜0.05)，隨后表達(dá)水平降低，在后期器官發(fā)育階段緩慢上升。ocuerβ2在 1細(xì)胞期和卵裂期維持在一個(gè)較高水平，隨后表達(dá)量逐漸下降，從脊索空泡化完成后，表達(dá)量逐漸上升，且保持一個(gè)較高表達(dá)水平至孵化。

圖7 熒光定量PCR檢測(cè)弓背青鳉胚胎發(fā)育各時(shí)期中erα、erβ1和erβ2表達(dá)量Fig.7 The expression of ocuer in embryonic development stage of Oryzias curvinotus by RT- qPCR

2.4 E2暴露下弓背青鳉仔魚(yú)雌激素受體基因的表達(dá)特性

圖8 熒光定量PCR檢測(cè)不同濃度的雌激素E2暴露后基因表達(dá)量Fig.8 The expression of relative gene in larva of Oryzias curvinotus by RT- qPCR

對(duì)剛出膜的弓背青鳉仔魚(yú)進(jìn)行不同濃度的 E2暴露處理，結(jié)果如圖8顯示。相對(duì)于對(duì)照組，經(jīng)過(guò)不同濃度下的E2暴露處理，ocuerα在20 μg/L組中顯著上調(diào)6.7倍(P＜0.001)，且呈現(xiàn)出低濃度強(qiáng)誘導(dǎo)，高濃度較弱誘導(dǎo)的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)；ocuerβ1僅在20 μg/L 組中顯著上調(diào)(P＜0.05)；ocuerβ2表達(dá)受到抑制，在高濃度組中表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.01)；雌激素效應(yīng)分子標(biāo)記物ocuvtg表達(dá)量也呈上調(diào)趨勢(shì)，應(yīng)答模式為中低濃度強(qiáng)上調(diào)，高濃度受到較弱的誘導(dǎo)表達(dá)。

3 討論

3.1 弓背青鳉雌激素受體序列分析

本研究克隆弓背青鳉 3種雌激素受體基因(ocuerα/erβ1/erβ2)，3 種亞型分別與各自的 ER 亞型聚為一類，提示雌激素受體基因在物種進(jìn)化上具有較高的保守性。序列分析顯示，弓背青鳉雌激素受體與日本青鳉、海水青鳉、斑馬魚(yú)、智人(Homo sapiens)及小鼠氨基酸序列相似，屬于典型的核受體超家族的一員。在ocuEr氨基酸序列的A/B區(qū)中，同時(shí)含有潛在的MAPK磷酸化位點(diǎn)，但序列比對(duì)顯示差異性較大，在轉(zhuǎn)錄激活功能上，三種亞型可能具有較大差異[22]。C區(qū)含有P-box和D-box，E區(qū)含有依賴配體的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域AF-2，且氨基酸序列高度相似，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果符合[23]。F區(qū)比對(duì)顯示差異性較大，可能在促進(jìn) ERα/Sp1激活過(guò)程[24]，控制基因轉(zhuǎn)錄大小[25]，與E區(qū)相互作用抑制受體二聚化[26]上有較大差異性。

3.2 弓背青鳉雌激素受體組織表達(dá)特征

組織分布顯示，弓背青鳉雌激素受體在眼、肌肉、腦、肝臟、性腺和鰓均有不同程度的表達(dá)，與以往研究類似（表2）。各亞型在不同性別或不同組織間表達(dá)豐度不同，表明其在不同組織可能參與不同的生理功能。在斑馬魚(yú)肝臟中，依賴于E2的卵黃生成素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能與Erα和Erβ2的協(xié)同作用有關(guān)[30]。ER受體與E2結(jié)合，誘導(dǎo)肝臟合成卵黃蛋白原[39]，合成的卵黃蛋白原被釋放到血液中，轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)育中的卵母細(xì)胞。在大菱鲆卵黃蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，erα起重要作用，因?yàn)橥庠吹腅2暴露可上調(diào)肝erα的表達(dá)，但erα并不是唯一調(diào)節(jié)卵黃蛋白基因表達(dá)的er亞型；erβ亞型的介導(dǎo)也被認(rèn)為是E2促進(jìn)卵黃蛋白合成的重要因素[9]。基于金魚(yú)研究，Nelson等[40]提出這3種ER在肝臟的功能假設(shè)：17β-雌二醇誘導(dǎo)卵黃原蛋白在包括金魚(yú)在內(nèi)的卵生動(dòng)物肝臟中產(chǎn)生，erα上調(diào)是由雌二醇通過(guò)激活erβ亞型而誘導(dǎo)的，這種誘導(dǎo)使雌二醇對(duì)肝臟刺激進(jìn)一步放大，增加肝臟對(duì)雌二醇的敏感性；erα的上調(diào)能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、生殖發(fā)育和卵黃發(fā)生，erβ1和erβ2參與維持Erα的正常水平。弓背青鳉3種er亞型在肝臟的表達(dá)特征，推測(cè)3種亞型在肝臟中可能共同行使著介導(dǎo)合成卵黃蛋白原功能，這為Nelson的假說(shuō)添加佐證。

表2 不同物種的雌激素受體組織分布特征Table 2 The tissue distribution of er genes in different species

除在肝臟中參與卵黃蛋白合成外，在魚(yú)類中ER有著介導(dǎo)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟相關(guān)信號(hào)通路的功能[37,41]。日本青鳉卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中卵泡顆粒細(xì)胞erα表達(dá)水平較高[10]。大菱鲆卵巢中er3種亞型均表現(xiàn)出高表達(dá)水平，以調(diào)節(jié)卵泡卵黃發(fā)生成熟[9]。弓背青鳉3種亞型在卵巢的高表達(dá)情況符合前人報(bào)道，然而ocuerα和ocuerβ2在精巢中也表現(xiàn)出較高表達(dá)。以往認(rèn)為雌激素是雌性特有的內(nèi)源性激素，然而越來(lái)越多的研究揭示雌激素在雄性動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育與性成熟中起重要調(diào)節(jié)作用[42]。在哺乳類中，雌激素對(duì)雄性小鼠的肝臟再生和器官對(duì)胰島素敏感性有正向調(diào)節(jié)作用[43-45]；通過(guò)讓介導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)導(dǎo)的Er突變，突變小鼠表現(xiàn)出更低的攻擊行為[46]，雄性突變體由于睪丸體細(xì)胞和外生導(dǎo)管系統(tǒng)的雌激素作用中斷而不育，影響雄性生殖能力[47]。

在魚(yú)類中，已有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)至少有1種雌激素受體存在精巢中[45,48]，并有相對(duì)較高的表達(dá)[10,28,35,49]。Senarat等發(fā)現(xiàn)在短體羽鰓鮐(Rastrelliger brachysoma)的精巢和精子發(fā)生中存在Gnrh、Gths和 Erα[50]。對(duì)虹鱒精子研究發(fā)現(xiàn)，er介導(dǎo)雌激素調(diào)控與早期精子發(fā)生、成熟和排出[51]。弓背青鳉er在精巢的表達(dá)特征與眾多的研究相似，提示在精子發(fā)生、成熟等方面，可能er起著重要介導(dǎo)作用，并且這種現(xiàn)象在脊椎動(dòng)物中具有較高保守性[52]。

3.3 弓背青鳉胚胎發(fā)育雌激素受體的表達(dá)特征

雌激素通過(guò)雌激素受體的介導(dǎo)，參與胚胎的生長(zhǎng)調(diào)控。弓背青鳉胚胎中，er不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量結(jié)果顯示，ocuerα早期表達(dá)量較低，經(jīng)囊胚發(fā)育后隨著細(xì)胞數(shù)目增多、各部位器官發(fā)育表達(dá)量逐漸上升，這與李丹丹等[53]報(bào)道的小鼠胚胎發(fā)育中，erα表達(dá)特征相似。推測(cè)弓背青鳉胚胎發(fā)育的早期是先由母源mRNAs和蛋白質(zhì)調(diào)控，隨著卵裂進(jìn)行，細(xì)胞數(shù)目增多，需要新的合子型 RNA和蛋白質(zhì)調(diào)控后續(xù)的發(fā)育過(guò)程，但合子型基因需要時(shí)間激活，所以囊胚后才檢測(cè)到erα表達(dá)。對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)[29]，3種亞型在胚胎發(fā)育的早期有強(qiáng)烈表達(dá)變化，erα和erβ1隨著胚胎發(fā)育表達(dá)量逐漸上升；erβ2表現(xiàn)為早期高表達(dá)，隨后顯著降低，后期又逐漸上升。斑馬魚(yú)胚胎在24 hpf前，erα無(wú)明顯表達(dá)；erβ1和erβ2由于從母源繼承，表達(dá)量高，隨后被消耗或降解表達(dá)量下降；48 hpf時(shí)，erβ1表達(dá)量高于erβ2[54]。Feist等人[55]測(cè)量了虹鱒胚胎中包括雌激素在內(nèi)的類固醇濃度，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)孵化周期中類固醇濃度呈雙峰型，隨著母源的類固醇消耗，類固醇濃度在發(fā)育的早期逐漸下降；隨后在孵化前濃度增加。ocuerβ亞型在胚胎發(fā)育中顯示出前期高水平，隨后表達(dá)降低，而后水平逐漸升高，這可能是ocuerβ亞型在胚胎發(fā)育中，起著與其他物種類似功能，且表達(dá)量變化可能與雌激素水平有關(guān)。

3.4 E2暴露對(duì)弓背青鳉仔魚(yú)雌激素受體的表達(dá)影響

卵黃蛋白(Vitellogenin,vtg)是卵黃的前體蛋白，通常存在于雌性動(dòng)物的血液中，常被用作脊椎動(dòng)物中環(huán)境雌激素暴露的生物標(biāo)記物[56]。魚(yú)類er對(duì)于雌激素的響應(yīng)，不同的er亞型具有不同的表達(dá)特征，這取決于物種、組織、性別、繁殖狀態(tài)和發(fā)育階段[22,57-59]。Marlatt等[60]對(duì)虹鱒研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)剛孵化的仔魚(yú)進(jìn)行1 μg/L的E2暴露，相對(duì)于對(duì)照組，erβ1和erβ2表達(dá)量均下降。也有研究報(bào)道[61]，在外源 E2作用下，erα和vtg水平同時(shí)升高，但erβ亞型則呈現(xiàn)減少或沒(méi)有變化。弓背青鳉仔魚(yú)er在E2暴露后表現(xiàn)出不同的變化情況，可能如 Nelson等[62]所推測(cè)，各亞型雌激素受體組成調(diào)控整體，彼此之間相互調(diào)節(jié)，使其在介導(dǎo)雌激素轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育中能發(fā)揮充分的作用。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究克隆出弓背青鳉3種亞型er序列，定量結(jié)果表明3種er亞型主要在成魚(yú)的肝臟和雌雄性腺表達(dá)，且ocuerα和ocuerβ1存在肝臟的表達(dá)呈性別二態(tài)性，支持er在兩性生殖中的重要性和雌雄分化。在仔魚(yú)早期發(fā)育階段E2暴露會(huì)抑制ocuerβ1、ocuerβ2表達(dá)，揭示ocuerβ亞型的表達(dá)在介導(dǎo)魚(yú)類對(duì)E2敏感性中具有重要作用。此外，弓背青鳉雌激素受體間調(diào)節(jié)功能尚需通過(guò)基因定位、過(guò)表達(dá)和敲除等技術(shù)進(jìn)一步研究。