高效凝膠色譜法測定注射用美羅培南聚合物含量

于會賢 ，黃世青，石 凱

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110015；2.深圳華藥南方制藥有限公司，廣東 深圳 518106）

美羅培南是廣譜碳青霉烯類抗生素，它是第一個可單獨(dú)給藥的4β-甲基碳青霉烯類抗生素，為臨床常用的抗菌藥物之一。抗生素分子本身作為半抗原通常不能直接引發(fā)過敏反應(yīng)，但藥物中存在的高分子雜質(zhì)是引發(fā)各種速發(fā)性過敏反應(yīng)的過敏原[1]。β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)一般分為外源性和內(nèi)源性兩種，其中外源性雜質(zhì)一般由發(fā)酵工藝中的蛋白質(zhì)、多肽、多糖等雜質(zhì)與抗生素結(jié)合而產(chǎn)生，而內(nèi)源性雜質(zhì)則為抗生素藥物自身聚合的高分子雜質(zhì)，即為抗生素聚合物。聚合物既可來自生產(chǎn)過程，又可在貯藏過程中形成，甚至在用藥時也可產(chǎn)生。隨著生產(chǎn)工藝的不斷提高，產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，內(nèi)源性聚合物的控制則應(yīng)為當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點(diǎn)。

中華人民共和國藥典自2000年版起，已對多個β-內(nèi)酰胺抗生素中的聚合物進(jìn)行控制，所采用的方法均為葡聚糖凝膠Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)。然而Sephadex G-10凝膠色譜柱柱效低，分離效果差，因此目前國內(nèi)逐漸開始采用高效凝膠色譜柱測定聚合物，常用Superdex Piptide色譜柱及TSK系列色譜柱進(jìn)行測定[2]。本文采用Sephadex G-10與TSK GEL G2000SW/600凝膠色譜柱檢測美羅培南聚合物并進(jìn)行對比分析，建立了采用TSK GEL G2000SW/600凝膠色譜柱檢查美羅培南聚合物的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（島津LC-10AT型泵、SPD-20A型紫外檢測器、LC Solution液相色譜數(shù)據(jù)工作站，日本島津公司）；Sephadex G-10色譜柱（300 mm×13 mm）和TSK GEL G2000SW/600凝膠色譜柱（600 mm×7 mm）；Starious BT125D型電子天平（賽多利斯）；PHSJ-3F精密酸度計（上海雷磁儀器廠）；CR-10LT型超純水儀（上海杲森）。

1.2 藥品與試劑

美羅培南對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130506-200702，含量87.0%）；注射用美羅培南（深圳華藥南方制藥）；原研參比樣品[商品名：美平，規(guī)格：0.5 g，批號：2015C，住友制藥（蘇州）有限公司]，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取美羅培南對照品約114 mg（含美羅培南無水物約100 mg）及無水碳酸鈉約10 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為美羅培南對照品溶液。需臨用前配制。

2.1.2 注射用美羅培南供試品溶液制備 取注射用美羅培南約13 mg（含美羅培南約10 mg），精密稱定，置入10 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為注射用美羅培南供試品溶液。需臨用前配制。

2.1.3 空白輔料溶液制備 取處方量的空白輔料適量，精密稱定，置入10 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為空白基質(zhì)溶液。

2.1.4 系統(tǒng)適用性溶液制備 將美羅培南對照品溶液于室溫下放置1 h，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2 色譜條件與測定法

以磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）[0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61:39）]為流動相，柱溫為30 ℃，流速為0.5 ml/min，檢測波長為254 nm。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算美羅培南聚合物的總量。

2.3 方法學(xué)考察

圖1 對照品溶液、供試品溶液及空白溶液的HPLC圖譜

2.3.1 專屬性試驗 精密量取美羅培南對照品溶液、注射用美羅培南供試品溶液、空白輔料溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

由圖1可見，供試品溶液中主峰與對照品溶液中主峰出峰位置一致，且空白輔料在主峰及聚合物峰位置均無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系試驗 精密稱取美羅培南對照品5.75，11.50，23.89，35.68，46.04 mg，分別置入10 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性關(guān)系試驗溶液，樣品溶液即配即用。精密量取各樣品溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，峰面積結(jié)果見表1。

表1 美羅培南濃度與聚合物測定結(jié)果相關(guān)性試驗

以美羅培南的濃度為橫坐標(biāo)（X），聚合物峰面積總和為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=97 603X+19 169，R2=0.9995；再以美羅培南的濃度為橫坐標(biāo)（X），美羅培南峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=16 556 344X+2 001 190，R2=0.9996。由試驗結(jié)果可知，美羅培南濃度為0.5040～4.0359 mg/ml范圍內(nèi)，美羅培南濃度與美羅培南及其聚合物的峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取注射用美羅培南及其對照品，照溶液配制方法制備注射用美羅培南供試品及對照品溶液，立即精密量取20 μl，注入液相色譜儀，同法配制6樣品，進(jìn)樣測定，樣品中聚合物的含量分別為0.491%，0.518%，0.504%，0.504%，0.514%，0.535%，平均值為0.511%，RSD為2.94%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于0，1，2 h進(jìn)樣，測得供試品溶液中高分子雜質(zhì)含量分別為0.52%，3.71%，5.11%，試驗結(jié)果顯示，在室溫條件下供試品溶液穩(wěn)定性差，供試品溶液應(yīng)臨用前配制。

2.4 樣品測定

取注射用美羅培南供試品及參比樣品，照2.2項測定，記錄色譜圖，計算聚合物含量，各批樣品檢測結(jié)果見表2。

表2 注射用美羅培南聚合物檢查結(jié)果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

分別選用Sephadex G-10及TSK GEL G2000SW/600凝膠柱進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗，精密量取系統(tǒng)適用性溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。采用Sephadex G-10色譜柱時，理論板數(shù)按聚合物峰計為1054，理論板數(shù)按美羅培南峰計為21，聚合物峰與美羅培南分離度為0.6；采用TSK GEL G2000SW/600凝膠柱，理論板數(shù)按美羅培南聚合物峰計，最小為6057，理論板數(shù)按美羅培南峰計為18 953，聚合物色譜峰與美羅培南峰分離度為1.8。

圖2 不同色譜柱的HPLC圖譜

由圖2可見，采用葡聚糖凝膠G-10色譜柱，主峰與高分子雜質(zhì)峰分離度較差，柱效低；采用TSK GEL G2000SW/600色譜柱，主峰與高分子雜質(zhì)峰分離度較好、柱效較高。

3.2 流速的選擇

分別以0.8，0.5 ml/min的流速進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗，結(jié)果顯示，兩流速條件下均能使美羅培南主峰與其前的高分子雜質(zhì)峰完全分離，但當(dāng)流速為0.5 ml/min時，雜質(zhì)分離度更好，積分更為準(zhǔn)確；流速0.8 ml/min時，色譜柱的柱壓相對較高，因此，選擇流速為0.5 ml/min為宜。

分子排阻色譜法為目前測定高分子聚合物的主要方法，其原理簡單、操作方便，是一種簡便易行的分離模式，目前國內(nèi)研究多采用此法來測定高分子聚合物，其中又以葡聚糖凝膠色譜系統(tǒng)最為常用[3-6]。但葡聚糖色譜系統(tǒng)分離效果較差，分析時間較長，國內(nèi)研究者已開始使用高效色譜系統(tǒng)對高分子聚合物進(jìn)行研究。