雪膽甲素及其衍生物的研究概況

喻 琨，劉愛芹，劉 波，姚慶強

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室 山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟(jì)南 250062）

雪膽甲素（cucurbitacin IIa，Cu IIa）主要存在于葫蘆科雪膽屬植物雪膽（Hemsleya）的塊根中，具有抗腫瘤、抑菌、抗胃潰瘍、清熱、解毒、止痛、抗HIV和細(xì)胞毒活性等作用，廣泛用于治療肝炎、冠心病和氣管炎等疾病[1]。目前對雪膽甲素及其衍生物的研究較多，在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，我們對雪膽甲素的含量測定、藥理作用、結(jié)構(gòu)修飾及活性研究等作一綜述，旨在為雪膽甲素的深入研究提供參考。

1 雪膽甲素簡介

雪膽甲素為葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物?；瘜W(xué)名為23,24-雙氫葫蘆苦素F-25-乙酸酯（23,24-dihydroxycucurbitacin F-25-acetate）；白色固體；分子式：C32H50O8，分子量：562.74，熔點226 ℃，易溶于丙酮、甲醇和乙醇，難溶于水和石油醚，對堿不穩(wěn)定。1975年陳維新等[2]從圓果雪膽中提取出雪膽甲素并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 雪膽甲素結(jié)構(gòu)

2 測定方法

目前應(yīng)用于雪膽甲素測定的方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、反相高效液相色譜法（RPHPLC）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLCELS）、薄層色譜法（TLC）、質(zhì)譜法（MS）等。

2.1 HPLC

何效平等[3]采用HPLC測定了雪膽中雪膽甲素的含量，結(jié)果表明：雪膽甲素在0.427～4.27 μg范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。此方法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于雪膽藥材中雪膽甲素的含量測定和質(zhì)量控制。李勝容等[4]采用HPLC測定了金洋冠心膠囊中雪膽甲素的含量，并建立了雪膽中活性成分雪膽甲素的含量測定方法。魏云[5]采用HPLC對長果雪膽、峨眉雪膽或巨花雪膽中雪膽甲素進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雪膽甲素進(jìn)樣量與峰面積在0.1255～2.51 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，此方法為雪膽的品質(zhì)評價提供了較好的依據(jù)。

2.2 RP-HPLC

施亞琴等[6]首次通過RP-HPLC建立了長果雪膽中雪膽甲素的含量測定方法，并對不同采收期長果雪膽中雪膽甲素含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，長果雪膽中雪膽甲素的含量在11月份時最高，為確定合理采收該植物的時間提供了根據(jù)。

2.3 HPLC-ELS

駱延波等[7]采用HPLC-ELS測定了雪膽溶液中雪膽甲素含量。雪膽溶液是雪膽經(jīng)提取后制成的單味藥制劑，其主要有效成分為雪膽甲素。由于雪膽甲素只在紫外末端有吸收，且為消除低波長（200～210 nm）處溶劑背景的干擾，進(jìn)一步提高檢測的精確度，采用HPLC測定雪膽甲素的含量，并使用蒸發(fā)散射檢測器進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明此方法重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性好。

2.4 TLC

魏云[5]采用TLC和顯微鑒別法對雪膽進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC對雪膽甲素進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明長果雪膽、峨眉雪膽、巨花雪膽均與對照品在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，且具有明顯的鑒別特征，并得出結(jié)論：峨眉雪膽中雪膽甲素的含量在秋末時節(jié)比夏初時節(jié)高出一倍。

2.5 MS

呂世明等[1]采用MS和HPLC對大籽雪膽中的經(jīng)乙醇提取，乙酸乙酯純化，丙酮沉淀后的結(jié)晶物進(jìn)行檢測，并對其準(zhǔn)分子離子進(jìn)行ESI碰撞誘導(dǎo)裂解規(guī)律進(jìn)行分析，確證其雪膽甲素的含量為95.1%。陳維新等[2]對圓果雪膽中雪膽甲素的MS峰進(jìn)行分析，得出雪膽甲素在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律，為雪膽甲素的MS鑒定提供了有效參考。

3 藥理作用

雪膽甲素具有抗腫瘤、抑菌、體外抗HIV活性和對實驗性胃潰瘍的保護(hù)作用等。

3.1 抗腫瘤

Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)雪膽甲素具有抑制人宮頸癌細(xì)胞（Hela細(xì)胞）的活性，其IC50為0.389 μmol/L。Boykin等[9]發(fā)現(xiàn)雪膽甲素可通過誘導(dǎo)肌動蛋白聚集、抑制JAK2/STAT3下游的生長素而誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷PARP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。高申等[10]發(fā)現(xiàn)雪膽甲素對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞有抑制作用。陳育林等[11]檢測雪膽甲素對肺癌細(xì)胞NCI-H460和A549的抑制活性，并檢測雪膽甲素對腫瘤細(xì)胞凋亡和周期的影響，得出雪膽甲素半抑制濃度（IC50）分別為224.9，108.3 nmol/L。

3.2 抑菌作用

Yi等[12]研究顯示雪膽甲素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)揮抗菌作用。李亮等[13]采用瓊脂二倍稀釋法對雪膽素片進(jìn)行體外抗菌活性測定，發(fā)現(xiàn)雪膽甲素對革蘭陽性菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.0036～0.75 mg/ml，對革蘭陰性菌的MIC為0.0056～1.5 mg/ml。

3.3 體外抗HIV活性

Tian等[14]測定了雪膽甲素的體外抗HIV活性，結(jié)果表明雪膽甲素抑制HIV-1誘導(dǎo)合胞體形成的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）為3.09 μg/ml。

3.4 抗炎作用

何建等[15]發(fā)現(xiàn)雪膽甲素可明顯地抑制巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖，使用Transwell法得出雪膽甲素可有效地抑制巨噬細(xì)胞RAW 264.7的遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生聚集。李藝丹等[16]發(fā)現(xiàn)雪膽炮制前后都能明顯提高小鼠的痛閾，且甘草汁炮制后的雪膽抗炎鎮(zhèn)痛作用更加明顯。

3.5 減輕實驗性肝損傷

柳愛華等[17]建立了四氯化碳急性肝損傷動物模型，探討高（500 mg/kg）、中（250 mg/kg）、低（50 mg/kg）劑量口服雪膽素減輕肝損傷的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的雪膽素均能減輕四氯化碳所致的肝損傷，其中高劑量保護(hù)作用最為顯著。

3.6 防治實驗性胃潰瘍

宛蕾等[18]采用大鼠醋酸致胃潰瘍、幽門結(jié)扎性胃潰瘍、應(yīng)激性胃潰瘍等模型研究雪膽提取物對實驗性胃潰瘍的作用，發(fā)現(xiàn)以雪膽素為主的提取物可使胃潰瘍指數(shù)降低，且有抑菌、鎮(zhèn)痛、抗炎作用。

4 雪膽甲素結(jié)構(gòu)修飾

文獻(xiàn)報道了雪膽甲素的多種結(jié)構(gòu)修飾物，多數(shù)修飾物顯示出與雪膽甲素不同的生物活性。

4.1 25位乙?；霓D(zhuǎn)移反應(yīng)

王方材等[19]用適量氫氧化鉀-乙醇溶液溶解雪膽甲素（1），加熱回流，鹽酸催化，氯仿提取，水洗干燥，氯仿重結(jié)晶得到化合物2和化合物3，結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 化合物1～3的結(jié)構(gòu)式

4.2 酯類衍生物

Guo等[20]為研究雪膽甲素酯類衍生物抗乙肝病毒活性，對其2，3和16位游離羥基進(jìn)行酯化修飾。雪膽甲素（1）與相應(yīng)酐類在吡啶溶液中室溫反應(yīng)得到單或雙酰類化合物A1～A7；將雪膽甲素（1）與酐類或羧酸類在4-二甲氨基吡啶（DMAP）中反應(yīng)得到三酰類化合物B1～B5；將雪膽甲素與間氯過氧苯甲酸（m-CPBA）反應(yīng)，得到5,6位環(huán)氧化化合物C，化合物C在酸酐，DMAP和吡啶中反應(yīng)得到化合物D系列衍生物；雪膽甲素與m-CPBA反應(yīng)得到化合物E；化合物B1，B4和B5在二氯甲烷中與m-CPBA反應(yīng)，得到化合物F1～F3。多數(shù)衍生物的抗HBV活性有所增強，其中A1～A7，B5，C和E表現(xiàn)出明顯的抑制HBV DNA復(fù)制的活性，其IC50值為2.8～11.6 μmol/L；化合物A1～A3，A5，B5和C表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，其安全指數(shù)（SI）值分別為89.7，55.6，77.8，＞83.4，＞55.8和＞150.5。衍生物A1～A7，B1～B6的結(jié)構(gòu)式見圖3，衍生物C、D1～D5、E和F1～F3的結(jié)構(gòu)式見圖4。

4.3 新骨架

Ren等[21]根據(jù)雪膽甲素20位存在羥基和22位存在羰基，設(shè)計將羰基還原為羥基，利用酰化保護(hù)2，3和16位羥基后，使用NaIO4等斷開20～22位鄰二羥基后，消去16位乙酯基得到16～17位雙鍵新骨架Q，結(jié)構(gòu)見圖5。新骨架Q可繼續(xù)修飾衍生成新的化合物。

圖3 酯類衍生物A1～A7，B1～B6的結(jié)構(gòu)式

圖4 酯類衍生物C、D1～D5、E和F1～F3的結(jié)構(gòu)式

圖5 新骨架Q的結(jié)構(gòu)及合成

4.4 16位胺基衍生物

董晨歡[22]用Dess-Martin試劑將C-16位羥基氧化為酮，然后與鹽酸羥胺反應(yīng)生成肟，再用NaBH3CN，醋酸銨，15%三氯化鈦還原，得到雪膽甲素C-16位氨基衍生物，結(jié)構(gòu)見圖6。研究發(fā)現(xiàn)雪膽甲素有較好的腺苷5’-單磷酸活化蛋白激酶（AMPK） α2β1γ1激動活性，且16位氨基衍生物的活性亦較好（EC50分別為8.3，1.7 μmol/L）。

圖6 氨基衍生物結(jié)構(gòu)式

4.5 B環(huán)雙鍵衍生物

董晨歡[22]分別用靶碳催化還原雙鍵和用m-CPBA對雪膽甲素C-5,6位雙鍵進(jìn)行環(huán)氧化，得到相應(yīng)產(chǎn)物A，B，結(jié)構(gòu)見圖7。將化合物A，B在人源重組AMPK α2β1γ1分子模型上進(jìn)行了初步活性評價，測定結(jié)果顯示活性都有所提高，表明雙鍵不是雪膽甲素激活A(yù)MPK磷酸化的活性必需基團(tuán)。

圖7 雙鍵氫化、環(huán)氧化衍生物結(jié)構(gòu)式

5 展望

隨著研究的深入，雪膽甲素及其衍生物因有效而廣泛的生物活性受到更多關(guān)注。人們對雪膽甲素的提取分離、含量測定、藥理活性及其衍生物的合成等方面的研究也越來越多，目前已應(yīng)用于醫(yī)藥保健等行業(yè)。雪膽甲素在雪膽中含量較為豐富，提取方便，這為進(jìn)一步對雪膽甲素的結(jié)構(gòu)修飾和藥理活性研究提供了良好的條件。隨著天然藥物化學(xué)的蓬勃發(fā)展，中藥在國際上受到了更多的關(guān)注，雪膽甲素作為中藥雪膽中較為重要的成分，其更多藥理活性和結(jié)構(gòu)的優(yōu)化有待于我們更加深入的研究。