基于低場(chǎng)核磁共振技術(shù)的不同品牌黃明膠的快速鑒別初探

程素盼，姜姣姣，趙恒強(qiáng)，郭興峰，張渝潔，崔 莉，王 曉，耿巖玲*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059；4.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005）

黃明膠（cattle-hide glue）作為養(yǎng)血止血良藥載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)》，是?？苿?dòng)物黃牛的皮經(jīng)熬制并佐以黃酒、豆油等加工而成，性味甘平，主入肺、大腸經(jīng)，具有滋陰潤(rùn)燥、養(yǎng)血止血的功效，臨床上常用于治療體虛便秘、腎虛遺精、吐血、嘔血，胎漏、崩漏等癥[1-4]。近年，隨著消費(fèi)者健康養(yǎng)生意識(shí)的逐步提高，膠類藥材成為消費(fèi)者日常滋補(bǔ)的選擇之一，其中阿膠與黃明膠都是比較常見的滋補(bǔ)膠類藥材，既可作為藥品，又可作為普通食品[5-7]。目前市場(chǎng)上以阿膠為貴，阿膠的偽品較多且倍受重視，相較而言，黃明膠作為一味已上市的非處方藥報(bào)道很少[1]，尚未實(shí)現(xiàn)不同品牌黃明膠的區(qū)分辨識(shí)[8]，亟需一種簡(jiǎn)便、快速、無(wú)損的鑒別不同品牌黃明膠的方法。

目前，膠類藥材的鑒定技術(shù)主要有：液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)多肽片段[8]，雙向凝膠電泳[9]及DNA鑒定技術(shù)[10]。膠類藥材被酶解后，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）進(jìn)行多肽識(shí)別，需要大量的測(cè)試、對(duì)比及后期驗(yàn)證工作，若在此基礎(chǔ)上建立不同膠類藥材酶解的特異性肽段及質(zhì)譜信息庫(kù)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)膠類藥材的專屬性鑒別有重要價(jià)值，但如何找到一個(gè)可切割出盡量多特征肽段的蛋白酶難度較大。雙向電泳與單獨(dú)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）或等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF-PAGE）相比，其分辨率更高，可直觀地找出具有差異性的蛋白點(diǎn)，是目前較常見的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，但缺點(diǎn)是樣品中鹽、脂質(zhì)等對(duì)此法影響嚴(yán)重且重現(xiàn)性較差。DNA鑒定法對(duì)于含其他種源性成分的膠類藥材可進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，但成本高。因此開發(fā)一種快速、有效且操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，是十分有意義的。

低場(chǎng)核磁共振（LF-NMR）是一種可靠的、信息豐富的非侵入性分析技術(shù)，可探尋天然產(chǎn)物中小分子的質(zhì)子，因其快速、無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于對(duì)食品和藥物的質(zhì)量控制研究[11-18]。相比傳統(tǒng)的膠類鑒定手段，LF-NMR技術(shù)具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[19-20]：（1）過程簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的前處理；（2）安全性好；（3）檢測(cè)速度快；（4）無(wú)損：無(wú)需加入試劑、不浪費(fèi)樣品，特別適合價(jià)格昂貴樣品的真?zhèn)舞b別。本研究以不同廠家黃明膠為研究對(duì)象，結(jié)合主成分法（PCA）對(duì)所獲得的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，為探索LF-NMR鑒別不同品牌黃明膠提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

NMI20-Analyst核磁共振分析儀（上海紐邁）；飛利浦料理機(jī)HR2874/00（飛利浦電子公司）；ME20型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。5個(gè)不同廠家黃明膠樣品具體信息見表1。

表1 黃明膠樣品來(lái)源

2 方法

2.1 樣品制備

將表1中5個(gè)不同品牌黃明膠樣品分別經(jīng)料理機(jī)粉碎后，過40目篩，備用。

2.2 樣品檢測(cè)

取樣品粉末10 g，置入20 mm核磁管底部，于35 ℃下使用LF-NMR在CPMG脈沖序列下采集信號(hào)，設(shè)置參數(shù)如表1，每類樣品設(shè)置8個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，求取平均值。

表2 應(yīng)用脈沖序列參數(shù)

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Multi Exp Inv Analysis軟件對(duì)不同品牌黃明膠樣品CPMG回波峰點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行反演擬合，并使用SPSS 22.0軟件對(duì)反演后的T2弛豫時(shí)間、峰面積S2及峰面積所占比例P進(jìn)行主成分分析（PCA），采用Origin 8.5對(duì)結(jié)果進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同品牌黃明膠的T2反演圖譜

圖1顯示了5個(gè)不同品牌黃明膠的橫向弛豫時(shí)間圖譜，由圖1可見，5個(gè)不同品牌的黃明膠均包含3個(gè)峰：T21、T22和T23。5個(gè)品牌黃明膠進(jìn)行兩兩比較，弛豫時(shí)間T2和峰面積S2均明顯不同。LF-NMR結(jié)果見表3。由表3可見，任取2個(gè)不同品牌的黃明膠進(jìn)行對(duì)比，6個(gè)變量中至少有4個(gè)變量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 不同品牌黃明膠LF-NMR結(jié)果

圖1 不同品牌黃明膠的橫向弛豫圖譜

3.2 不同品牌黃明膠的PCA結(jié)果

主成分分析（principal component analysis，PCA）是模式識(shí)別中較常用的多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法[21]。在不丟掉原來(lái)主要信息的前提下，從多個(gè)數(shù)值變量（指標(biāo)）之間的相互關(guān)系入手，利用降維的思想，將原來(lái)的多個(gè)指標(biāo)組合成少數(shù)幾個(gè)互不相干的綜合指標(biāo)，形成特征向量。利用降維后的特征向量作PCA散點(diǎn)圖，使數(shù)據(jù)可視化，進(jìn)而直觀地反映樣品之間的整體差異。

選取反演后得到5個(gè)品牌黃明膠樣品信息的9個(gè)變量（T21、T22、T23峰起始時(shí)間、峰面積S21、S22、S23及相應(yīng)峰面積所占比例P）進(jìn)行PCA，根據(jù)PCA原理，主成分1為圖2中橫坐標(biāo)，主成分2為縱坐標(biāo)，其中包含了各主成分在PCA轉(zhuǎn)換中的貢獻(xiàn)率。總貢獻(xiàn)率大于70%～85%的方法即可使用[22-24]，貢獻(xiàn)率越大，說明主成分可較好地反映原始變量信息。圖2為5個(gè)品牌黃明膠前兩個(gè)主成分PC1和PC2的得分圖，圖中每個(gè)樣品的整體特性用一個(gè)圈表征，其中8個(gè)小點(diǎn)代表此樣品的平行樣品。不同樣品類間品質(zhì)差異與樣品間隔距離成正比，距離越遠(yuǎn)樣品品質(zhì)差異越大[25]。

圖2 不同品牌黃明膠的PCA得分圖

根據(jù)表3不同品牌黃明膠之間差異性比較，將反演后得到的9個(gè)變量（T21、T22、T23峰起始時(shí)間、峰面積S21、S22、S23及相應(yīng)峰面積所占比例P）均進(jìn)行PCA。PC1和PC2得分累積貢獻(xiàn)率為97.38%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為91.73%，即保留了91.73%的原始數(shù)據(jù)信息，PC2包含了5.65%的信息。由圖2可見，5種不同品牌的黃明膠分布距離較遠(yuǎn)，雖在PC1軸上得不到準(zhǔn)確區(qū)分，但結(jié)合PC2軸后，均能兩兩區(qū)分開來(lái)，推測(cè)是由于不同品牌黃明膠生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)用水、所用輔料等存在一定的差異[25]，導(dǎo)致LF-NMR結(jié)果存在明顯差異，在PCA得分圖上被很好地體現(xiàn)出來(lái)。

4 結(jié)論

LF-NMR作為一種現(xiàn)代化檢測(cè)分析技術(shù)，在鑒別不同品牌膠類藥材中具有較大的應(yīng)用潛力，無(wú)需添加其他化學(xué)試劑和復(fù)雜前處理，樣品不受污染與破壞，制樣方便，耗時(shí)短，屬于一種非破壞快速檢測(cè)手段。結(jié)果表明，結(jié)合PCA，LF-NMR能有效地反應(yīng)出不同品牌黃明膠的差異，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品牌黃明膠的區(qū)分、辨識(shí)。