抗流感藥法匹拉韋雜質(zhì)的合成

鄧玉曉，段崇剛，林治秘，李 丹，任業(yè)明，孫晉瑞

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

法匹拉韋（favipiravir，商品名為Avigan），化學(xué)名為6-氟-3-羥基吡嗪-2-甲酰胺，是由日本富士膠片旗下富山化學(xué)工業(yè)公司研發(fā)的一種新型流感治療藥物，2011年3月在日本完成Ⅲ期臨床試驗，2014年3月被日本政府批準(zhǔn)上市[1]。2014年3月，日本厚生勞動省批準(zhǔn)其用于治療新型和復(fù)發(fā)型流感[2]； 2015年7月13日被臺灣批準(zhǔn)上市用于治療流感；2016年6月14日被幾內(nèi)亞批準(zhǔn)用于治療埃博拉病毒[3]。本品為病毒RNA聚合酶抑制劑，能選擇性阻斷病毒RNA的合成，對哺乳動物細胞內(nèi)的RNA合成不會產(chǎn)生任何抑制作用，因此，是一種安全有效的抗病毒藥物[4]。由于其特定的作用機制，除流感病毒外，法匹拉韋還可對抗其他多種RNA病毒，如HIV、黃熱病、SARS、埃博拉等[5]。

目前，文獻[6-8]報道的路線中，具有工業(yè)化前景的為3,6-二氯吡嗪-2-甲腈（化合物2）在相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基溴化銨（Bu4N+Br-）的催化下，與無水氟化鉀發(fā)生雙氟取代反應(yīng)，得3,6-二氟吡嗪-2-甲腈（化合物3）；再與醋酸和三乙胺作用生成6-氟-3-羥基吡嗪-2-甲腈（化合物4）；最后在濃硫酸作用下水解生成法匹拉韋。合成路線詳見圖1。

圖1 法匹拉韋的合成路線

筆者查閱了大量文獻，均未檢索到法匹拉韋雜質(zhì)相關(guān)報道，為了控制法匹拉韋的質(zhì)量，必須建立嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)大量的實驗探索和求證，最終確證了兩個雜質(zhì)：6-氯-3-羥基吡嗪-2-甲酰胺（雜質(zhì)1）和6-氟-3-羥基吡嗪-2-甲酸（雜質(zhì)2），同時研究了相關(guān)雜質(zhì)的制備方法，以為該產(chǎn)品的相關(guān)技術(shù)人員提供參考。

圖2 法匹拉韋合成中兩種主要雜質(zhì)

從化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子活性角度分析，化合物2在3位和6位均有一個氯原子取代，然而，與兩個氯原子直接相連的碳原子的親電活性卻相差較大，3位碳原子由于受到芳香環(huán)上相鄰氮原子和鄰位氰基的雙重吸電子作用，電子云密度較低，極易受到氟離子的進攻，發(fā)生氟代反應(yīng)； 6位碳原子受到芳香環(huán)上相鄰氮原子的吸電子作用，而氰基卻位于其間位，對其吸電子作用較小，電子云密度相對較高，所以，在相同條件下，有可能會產(chǎn)生3位氟代反應(yīng)完全，而6位氟代反應(yīng)不完全的情況，即生成3-氟-6-氯吡嗪-2-甲腈（化合物5），該化合物在冰醋酸和三乙胺作用下生成6-氯-3-羥基吡嗪-2-甲酰胺（化合物6），最后在濃硫酸作用下生成雜質(zhì)1。由于化合物3中副產(chǎn)物5的含量較低，且在法匹拉韋原料藥合成過程中轉(zhuǎn)化為雜質(zhì)1，并未在法匹拉韋原料藥中檢測到化合物5和化合物6。雜質(zhì)1的來源流程圖詳見圖3。化合物4中2位氰基在酸性或堿性條件下水解，通過調(diào)節(jié)濃硫酸的濃度和反應(yīng)溫度可控制反應(yīng)主產(chǎn)物為法匹拉韋，但是過度水解產(chǎn)物雜質(zhì)2卻很難避免，這一點在相關(guān)文獻[9]中已有詳盡報道。

圖3 雜質(zhì)1的來源流程圖

1 合成路線

1.1 雜質(zhì)1的合成路線

相關(guān)文獻[10-11]報道了雜質(zhì)1的合成方法，即以6-氯-3-羥基吡嗪-2-甲酸甲酯為起始原料，通過酯的氨解得雜質(zhì)1。但酯的氨解反應(yīng)速度慢且反應(yīng)進行不徹底，所得產(chǎn)物中必然包含未反應(yīng)完全的原料，且由于反應(yīng)原料和產(chǎn)物極性相近，純化困難。合成路線詳見圖4。

圖4 文獻[10-11]中雜質(zhì)1的合成路線

本文采用3,6-二氯吡嗪-2-甲酰胺為起始原料，經(jīng)親核取代反應(yīng)、水解反應(yīng)得到雜質(zhì)1。起始原料易得，且反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物易分離純化。詳見圖5。

圖5 本文雜質(zhì)1的合成路線

1.2 雜質(zhì)2的合成路線

筆者查閱大量文獻，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)2的相關(guān)報道。我們以化合物4為起始原料，采用氫氧化鈉水溶液水解，然后用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH＜3，即得雜質(zhì)2。

圖6 雜質(zhì)2的合成路線

2 儀器與材料

2.1 儀器

Varian INOVA-300 核磁共振波譜儀（美國瓦里安公司）；4000 Q TRAP 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；IKA HB 10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城）；DZF型真空干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫）。

2.2 藥品與試劑

3,6-二氯吡嗪-2-甲腈（四川南部縣誠信公司，純度＞98.5%）；6-氟-3-羥基吡嗪-2-甲腈（四川南部縣誠信公司，純度＞98.5%）；二氯甲烷（天津富宇，分析純）；濃硫酸（國藥集團，分析純）；無水碳酸鉀（國藥集團，分析純）；N,N-二甲基甲酰胺（國藥集團，分析純）；乙酸乙酯（天津科密歐，分析純）；二甲苯（天津富宇，分析純）；無水乙醇（萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工，分析純）；氫氧化鈉（國藥集團，分析純）；無水硫酸鈉（國藥集團，分析純）；濃鹽酸（國藥集團，分析純）；石油醚（天津富宇，分析純，沸點60～90 ℃）。

3 方法與結(jié)果

3.1 6-氯-3-羥基吡嗪-2-甲腈（化合物6）的合成

取化合物2（5.0 g，0.029 mol）置入100 ml四口瓶，加無水碳酸鉀（7.94 g，0.057 mol），N,N-二甲基甲酰胺（25 ml），攪拌下油浴加熱，保持體系內(nèi)溫度50～60 ℃，反應(yīng)5 h。薄層色譜（TLC）顯示反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液加入100 ml水中，用乙酸乙酯（100 ml×3）萃取，合并有機相，用水（100 ml×3）洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液減壓蒸除溶劑，得黃色油狀物（4.13 g，收率：92.5%）。

3.2 6-氯-3-羥基吡嗪-2-甲酰胺（雜質(zhì)1）的合成

向50 ml四口瓶中加入化合物6（4.13 g，0.027 mol），濃硫酸（10 ml），攪拌下油浴加熱，保持體系內(nèi)溫度55～65 ℃，反應(yīng)1 h。TLC顯示反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液加入冰水（50 ml）中，用二氯甲烷（50 ml×3）萃取，合并有機相，用水（50 ml×3）洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過濾，濾液減壓蒸除溶劑，得黃色固體（4.32 g，收率：93.6%），為雜質(zhì)1粗品。向100 ml四口瓶中加入雜質(zhì)1粗品（4.32 g），無水乙醇（80 ml），攪拌下油浴加熱，保持回流約0.5 h，關(guān)閉加熱和攪拌，自然降至室溫，抽濾，得淡黃色針狀結(jié)晶（3.70 g，收率：85.7%）。mp：200.5～201.6 ℃（文獻[12]mp：200～202 ℃），HPLC純度：99.6%。ESI-MSm/z：172.6[M-H]-。1H NMR（300 MHz DMSO-d6）：8.61（s，2H），8.83（s，1H），13.66（s，1H）；13C NMR（300 MHz DMSO-d6）：169.5，157.9，142.5，140.3，128.4。

3.3 6-氟-3-羥基吡嗪-2-甲酸（雜質(zhì)2）的合成

向100 ml四口瓶中加入化合物4（5 g，0.036 mol），4 mol/L鹽酸（20 ml），攪拌0.5 h，攪拌下油浴加熱，保持回流約3 h。TLC顯示反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液加入冰水（50 ml）中，過濾，濾餅采用蒸餾水（50 ml×3）洗滌，60 ℃真空干燥至恒重，得棕色粉末（4.01 g，70.4%），為雜質(zhì)2粗品。向100 ml四口瓶中加入雜質(zhì)2粗品（4.01 g），石油醚（40 ml），室溫下打漿0.5～1 h，抽濾，得淡黃色粉末（3.87 g，收率：96.5%）。mp：178.8～180.2 ℃，HPLC純度：99.7%。ESI-MSm/z：157.0[M-H]-。1H NMR（300 MHz DMSO-d6）：8.50（s，1H），13.7（s，1H）；13C NMR（300 MHz DMSO-d6）：172.5，161.2，142.3，138.2，127.0。[雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的純度測定方法均為HPLC面積歸一化法，色譜條件：色譜柱：Intersil ODS-3，流動相：V緩沖溶液:V甲醇=45:55，緩沖溶液配置方法：0.5 g磷酸二氫鉀，1.0 g磷酸二氫鈉，加水1000 ml，搖勻即得，流速：1 ml/min，柱溫：30 ℃，進樣體積：20 μl，運行時間：40 min，檢測波長：238 nm]。

4 討論

4.1 本研究雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的合成所采用的起始原料易得，反應(yīng)條件溫和，未涉及高溫高壓超低溫等苛刻反應(yīng)條件，反應(yīng)的可操作性高。

4.2 采用重結(jié)晶或打漿的方法對2個雜質(zhì)提純，收率高，操作簡便，避免了硅膠柱純化等繁瑣操作步驟。

4.3 本研究合成的2個雜質(zhì)均純度高，性狀好，易于保存。

5 結(jié)論

本文分別以3,6-二氯吡嗪-2-甲腈和6-氟-3-羥基吡嗪-2-甲腈為起始原料，合成了法匹拉韋的兩個雜質(zhì)，并通過MS、1H NMR、13C NMR等方法進行了結(jié)構(gòu)確證。解決了2個雜質(zhì)對照品來源問題，對法匹拉韋的質(zhì)量控制有重要意義。