HPLC測定不同產(chǎn)地何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的含量

黃曉冰，黃靄霞，王光寧*，金海杰

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.云浮市厚德中藥飲片有限公司，廣東 云浮 527300）

何首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效，用于治療瘡癰，瘰疬，風(fēng)疹瘙癢，久瘧體虛，腸燥便秘[1]。何首烏自然資源分布廣泛，主產(chǎn)于廣東、四川、貴州、廣西等地，其中廣東德慶為道地產(chǎn)區(qū)，被譽為“何首烏之鄉(xiāng)”[2]。何首烏中主要含蒽醌類化合物、二苯乙烯苷等化學(xué)成分，蒽醌類成分主要為大黃素、大黃素甲醚等，以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)兩種形式存在于植物體內(nèi)[3]。研究表明二苯乙烯苷具有防治老年癡呆、提高記憶功能、抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防治動脈硬化及保護肝臟等作用[4]。蒽醌類成分如大黃素、大黃素甲醚、大黃酸等具有抗腫瘤及提高免疫功能的作用，但也與肝毒性相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地何首烏中蒽醌類和二苯乙烯苷含量存在一定差異[7]。本實驗以二苯乙烯苷、蒽醌等成分為指標(biāo)，建立何首烏藥材的質(zhì)量評價方法，并比較不同產(chǎn)地何首烏藥材的質(zhì)量優(yōu)劣。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AC高效液相色譜儀（日本島津）；SPDM20A紫外檢測器（日本島津）；Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AY12電子分析天平（日本島津）；LD-Y400粉碎機（上海頂帥）；DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 材料

貴州產(chǎn)何首烏購于亳州藥王谷醫(yī)藥有限公司，廣東德慶、廣東新興產(chǎn)何首烏均購自廣東銀田農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川產(chǎn)何首烏購自重慶慧遠藥業(yè)有限公司，以上藥材經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系李書淵教授鑒定均為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根。

二苯乙烯苷對照品（含量98.72%，批號：MUST-16121311），大黃素對照品（含量：99.48%，批號：MUST-17102702），大黃素甲醚對照品（含量：99.27%，批號：MUST-17030622），由成都曼斯特生物科技有限公司和中國科學(xué)院成都生物研究所共同研制；甲醇，乙腈（色譜純，購自德國Merck公司）；水為屈臣氏飲用水；甲醇，95%乙醇，無水乙醇，磷酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 二苯乙烯苷的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡糖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每l ml含0.2 mg對照品的溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，置入圓底燒瓶，精密加入稀乙醇25 ml，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置，上清濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相比例：乙腈-水（25:75）；流速：1 ml/min；檢測波長：320 nm；柱溫：25 ℃。進樣量：20 μl。理論塔板數(shù)按2,3,5,4’-四羥基二苯乙稀-2-O-β-D-葡糖苷峰計算不低于2000。

2.1.4 專屬性 取二苯乙烯苷對照品溶液和樣品溶液、空白溶劑，用0.45 μm微孔濾膜過濾后分別進樣，記錄圖譜如下。

圖1 二苯乙烯苷測定專屬性研究HPLC圖譜

由圖1可見，二苯乙烯苷對照品溶液與二苯乙烯苷樣品溶液的保留時間均為7.5 min左右，空白溶劑無干擾。

2.1.5 線性關(guān)系 取二苯乙烯苷對照品溶液，分別精密量取1，2，3，4，6，8 ml，置入10 ml量瓶，稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)擬合回歸方程。結(jié)果y= 18 660 167x+428 620，r=0.9990，在0.05～0.40 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，每隔一定時間進樣，測定24 h內(nèi)二苯乙烯苷峰面積變化情況，結(jié)果RSD為2.55%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 精密度實驗 取供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，連續(xù)進樣6次，測定二苯乙烯苷峰面積的變化情況，結(jié)果RSD為1.93%，說明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 分別取何首烏細粉6份，每份約0.2 g，精密稱定后按2.1.2項方法制成供試液，按2.1.3項色譜條件進樣，測得峰面積，計算含量。結(jié)果二苯乙烯苷的平均含量為2.58%，RSD為2.61%，重現(xiàn)性良好。

2.1.9 加樣回收率 取已知含量的何首烏粉末約0.05 g，精密稱定，平行6份。另精密稱定二苯乙烯苷對照品8 mg，置入10 ml量瓶，用稀乙醇溶解、定容。每份樣品加入對照品溶液1.5 ml（相當(dāng)于二苯乙烯苷1.2 mg），再精密加入11 ml稀乙醇，稱重，加熱回流30 min，放冷，過濾，取續(xù)濾液5 ml，置入10 ml量瓶，稀釋至刻度，作為供試品，按2.1.3項色譜條件進樣，測得峰面積，計算含量，結(jié)果見表1。平均加樣回收率為99.17%，RSD為0.92%，表明該方法的回收率符合要求。

表1 二苯乙烯苷的加樣回收實驗結(jié)果（n=6）

2.1.10 檢測限與定量限 精密量取二苯乙烯苷標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為二苯乙烯苷檢出限系列溶液。將對照品溶液稀釋后進樣檢測，記錄各色譜峰面積，以S/N=3作為檢出限檢測標(biāo)準(zhǔn)，以S/N=10作為定量限檢測標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果二苯乙烯苷的定量限為88.62 ng，檢出限為26.59 ng。

2.2 蒽醌類成分的HPLC測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取大黃素對照品、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別制成每1 ml含大黃素80 μg、大黃素甲醚40 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約l g，精密稱定，置入圓底燒瓶，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 ml，作為供試品溶液A（測游離蔥醌用）。另精密量取續(xù)濾液25 ml，置入圓底燒瓶，水浴蒸干，精密加8%鹽酸溶液20 ml，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHZ）5 min，加二氯甲烷20 ml，水浴中加熱回流1 h，取出，立即冷卻，置入分液漏斗，用少量二氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗，分取二氯甲烷液，酸液再用二氯甲烷振搖提取3次，每次15 ml，合并二氯甲烷液，回收溶劑至干。殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液B（測總蒽醌用）。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相比例：甲醇-0.1%磷酸（85:15）；流速：1 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。進樣量：20 μl。理論塔板數(shù)按大黃素峰計算不低于3000。

2.2.4 專屬性 取空白溶劑、大黃素對照品溶液、大黃素甲醚對照品溶液和供試品溶液A分別進樣，記錄圖譜，見圖2。

2.2.5 線性關(guān)系 分別精密量取大黃素對照品溶液0.5，1，2，4，6，8 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.3項色譜條件進樣分析。分別精密量取大黃素甲醚對照品溶液0.75，1.5，3，5，7，9 ml于10 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻后按2.2.3項色譜條件進樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。大黃素的回歸方程為：y=45 298 211x+4159（r=0.9999），在0.0055～0.1110 mg/ml范圍內(nèi)線性較好。大黃素甲醚的回歸方程為y=51 308 574x-530（r=0.9998），在0.003～0.040 mg/ml的范圍內(nèi)線性良好。

圖2 蒽醌測定專屬性研究HPLC圖譜

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液A，按2.2.3項色譜條件進樣分析，每隔一定時間進樣，記錄24 h內(nèi)大黃素和大黃素甲醚峰面積變化情況，結(jié)果RSD為1.37%，1.35%，說明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.7 精密度實驗 取供試品溶液A，按2.2.3項色譜條件進樣分析，連續(xù)進樣6次，記錄大黃素及大黃素甲醚的峰面積，結(jié)果RSD為1.21%，1.24%，說明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 分別取何首烏細粉 6 份，每份約1 g，按2.2.2項方法制備游離蔥醌供試液，按2.2.3項色譜條件進樣分析，記錄大黃素和大黃素甲醚的峰面積，計算含量和RSD。結(jié)果表明，大黃素平均含量為0.06%，RSD為1.88%，大黃素甲醚平均含量為0.025%，RSD為2.63%，結(jié)果表明大黃素和大黃素甲醚的重現(xiàn)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的何首烏粉末約0.25 g，平行6份，精密稱定。另精密稱定大黃素對照品1.5 mg，大黃素甲醚對照品0.5 mg，分別置入10 ml量瓶，用甲醇定容。樣品中加入大黃素對照品溶液1 ml （相當(dāng)于大黃素0.15 mg）和大黃素甲醚對照品溶液1 ml（相當(dāng)于大黃素甲醚0.05 mg），再精密加入23 ml甲醇，稱重，加熱回流1 h，放冷，過濾，取續(xù)濾液作為供試品，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2、表3。

表2 大黃素的加樣回收實驗結(jié)果（n=6）

表3 大黃素甲醚的加樣回收實驗結(jié)果（n=6）

由表2、表3可見，大黃素、大黃素甲醚的平均回收率分別為95.70%和103.79%，RSD分別為0.47%和0.8%，表明本方法的回收率良好。

2.2.10 檢測限與定量限 取大黃素、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為大黃素、大黃素甲醚檢出限系列溶液。將對照品溶液稀釋后進樣檢測，記錄各色譜峰面積，以S/N=3作為檢出限檢測標(biāo)準(zhǔn)，以S/N=10作為定量限檢測標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，大黃素的檢出限為9.74 ng，定量限為32.6 ng。大黃素甲醚的檢出限為3.33 ng，定量限為11.1 ng。

2.3 不同產(chǎn)地何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的含量測定

取不同產(chǎn)地樣品，按2.1.2項方法制成供試液，按2.1.3項色譜條件進樣，測定二苯乙烯苷含量。不同產(chǎn)地樣品按2.2.2項方法制成游離蒽醌和總蒽醌供試液，按2.2.3項色譜條件進樣分析，測定總蒽醌和游離蒽醌的含量，結(jié)合蒽醌含量為總蒽醌與游離蒽醌含量之差。結(jié)果二苯乙烯苷含量分別為：四川2.22%，貴州1.83%，德慶2.49%，新興2.39%，結(jié)合蒽醌含量分別為：四川0.39%，貴州0.44%，德慶0.48%，新興0.57%。

4個產(chǎn)地樣品的二苯乙烯苷和結(jié)合蒽醌含量均達到藥典要求。在這4個產(chǎn)地中德慶產(chǎn)的何首烏中二苯乙烯苷和結(jié)合蒽醌含量之和最高，說明德慶產(chǎn)的何首烏質(zhì)量較高。

3 討論

蒽醌類成分測定方法學(xué)考察中，游離蒽醌是指游離大黃素和游離大黃素甲醚，結(jié)合蒽醌是兩者與糖結(jié)合而成的苷，總蒽醌包含游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的大黃素和大黃素甲醚，結(jié)合蒽醌含量為總蒽醌與游離蒽醌含量之差。結(jié)合蒽醌測定前先水解為游離態(tài)再測定含量，因此方法學(xué)考察以游離蒽醌為樣品。

本文建立的二苯乙烯苷和蒽醌類含量測定方法不僅可用于何首烏藥材的質(zhì)量評價，也可用于含何首烏的復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。本文對蒽醌類HPLC測定色譜條件進行了優(yōu)化，比較了不同比例流動相的分離效果，結(jié)果表明流動相為甲醇-0.1%磷酸水（85:15）時大黃素和大黃素甲醚的峰形對稱且保留時間穩(wěn)定，可作為含量測定的流動相。

二苯乙烯苷為一種植物抗毒素，是由植物在紫外線照射、機械損傷、真菌感染等不利條件下產(chǎn)生的。何首烏的道地產(chǎn)地廣東德慶、新興等均位于廣東中部偏西，位于北回歸線附近，日照充足，紫外線照射豐富，氣候濕熱，有利于真菌的產(chǎn)生，因此該產(chǎn)地的何首烏中二苯乙烯苷含量較高。而貴州、四川等產(chǎn)地位于北回歸線以北，紫外線照射相對于廣東地區(qū)要少，且天氣不如廣東地區(qū)的濕熱，真菌活動受到影響，故二苯乙烯苷含量較廣東產(chǎn)區(qū)的低。本實驗結(jié)果表明，廣東德慶、新興產(chǎn)何首烏中二苯乙烯苷及結(jié)合蒽醌的含量高于四川、貴州產(chǎn)區(qū)，說明不同產(chǎn)區(qū)的何首烏中有效成分含量存在一定的差異，廣東道地產(chǎn)區(qū)的何首烏質(zhì)量較優(yōu)。