利膽顆粒質(zhì)量標準的研究

呂凌岳，梁大連，張岱州，李 敏，郭 琪，王 芳，張 偉

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101；3.青島市中醫(yī)院，山東 青島 266033）

利膽顆粒由青皮、白芍、姜黃、大黃、郁金等10味中藥組成，有疏肝利膽，行氣止痛，清熱解毒排石的功效，可用于治療慢性膽囊炎、膽囊結(jié)石、膽管炎、膽囊手術后綜合征及膽道功能性疾病。其中青皮、白芍和姜黃為君藥。芍藥苷作為白芍的主要有效成分，有解痙鎮(zhèn)痛、解熱降溫、抗炎、抗氧化、抗?jié)兗罢{(diào)節(jié)血脂等作用[1]；姜黃素（curcumin）是姜黃中的一種天然活性物質(zhì)，有抗氧化、抗炎等作用[2]。橙皮苷是青皮的主要有效成分，有抗炎、抗氧化、祛痰平喘、延緩衰老等作用[3]。為了有效控制自制制劑的質(zhì)量，本研究參照文獻，建立了定性鑒別芍藥苷和姜黃素的薄層色譜法和定量測定橙皮苷含量的高效液相色譜法，經(jīng)結(jié)果驗證，所建立的方法準確可靠，可用來有效控制利膽顆粒的質(zhì)量。為后續(xù)該新藥質(zhì)量標準的制訂奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫）、SB-5200DTD超聲波清洗機（寧波新芝）、 XA105電子分析天平（德國梅特勒）、紫外光譜儀：UV-2550PC 型。硅膠G薄層板（默克化工）。

1.2 試藥與試劑

芍藥苷對照品（批號110721-201617）、姜黃素對照品（批號110736-201640）、橙皮苷對照品（批號110820-201607）、姜黃對照藥材（批號121188-200502）、白芍對照藥材（批號120905-201610），均由中國食品藥品檢定研究院提供。

利膽顆粒：將青皮、白芍、姜黃、大黃、郁金等10味中藥（濟南建聯(lián)中藥店）按處方比例加入圓底燒瓶中，分別加入8倍量、6倍量、6倍量水回流提取3次，提取時間分別為1.5，1.5，1 h，合并提取液，靜置過夜，將上清濃縮至相對密度為1.30～1.35的清膏，60 ℃減壓干燥后，粉碎過80目篩，加入配比淀粉混合均勻。用乙醇制軟材，過12 目篩制濕顆粒，烘箱干燥，即得。

乙腈為色譜純（盛世薩格），水為純凈水（娃哈哈）；其他試劑均為分析純（西隴科學）。

2 方法

2.1 薄層鑒別

2.1.1 芍藥苷鑒別

2.1.1.1 溶液制備 對照品溶液 取芍藥苷對照品適量，精密稱取，加乙醇制成每1 ml含1 mg溶液，作為芍藥苷對照品溶液。

藥材對照溶液 取0.5 g白芍對照藥材置入錐形瓶，加甲醇20 ml，超聲提取20 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，濃縮至1 ml，作為白芍藥材對照溶液。

陰性對照溶液 將利膽顆粒處方去除白芍一味藥材，按照1.2項下相同的制備方法制得顆粒，精密稱取1 g置入錐形瓶，加入甲醇20 ml，超聲提取20 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，濃縮至1 ml，作為陰性對照溶液。

供試品溶液 取利膽顆粒1 g置錐形瓶中，加入甲醇20 ml，超聲提取20 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，濃縮至1 ml，作為供試品溶液。

2.1.1.2 薄層鑒別 吸取陰性對照溶液、藥材對照溶液、對照品溶液、供試品溶液各8 μl，點于同一硅膠G薄層板上，室溫下以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（15:2:1:3）于10 ℃下放置過夜的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。對照藥材溶液與對照品溶液在相同位置出現(xiàn)斑點，相應的位置上，供試品溶液出現(xiàn)斑點而陰性對照溶液則沒有。結(jié)果見圖1。

圖1 芍藥苷薄層色譜鑒別

2.1.2 姜黃素鑒別

2.1.2.1 溶液的制備 對照品溶液 取姜黃素對照品適量，精密稱取，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

藥材對照溶液 取0.5 g姜黃對照藥材置錐形瓶中，加甲醇20 ml，超聲提取20 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，濃縮至1 ml，稀釋25倍作為藥材對照溶液。

陰性對照溶液 將利膽顆粒處方去除姜黃一味藥材，按照1.2項下相同的制備方法制得顆粒，精密稱取1 g置入錐形瓶，加入甲醇20 ml，超聲提取20 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，濃縮至1 ml，作為陰性對照溶液。

供試品溶液的制備 取利膽顆粒1 g置錐形瓶中，加入甲醇20 ml，超聲提取20 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，濃縮至1 ml，作為供試品溶液。

2.1.2.2 薄層鑒別 吸取陰性對照溶液6 μl、藥材對照溶液2 μl、對照品溶液1 μl、供試品6 μl，點于同一硅膠G薄層板上，室溫下以二氯甲烷-甲醇-甲酸（96:4:0.7）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外燈（365 nm）下檢視。對照藥材溶液與對照品溶液在相同位置出現(xiàn)斑點，相應的位置上，供試品溶液出現(xiàn)斑點而陰性對照溶液則沒有。結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 姜黃素薄層色譜鑒別（日光下）

圖3 姜黃素薄層色譜鑒別（紫外燈下）

2.2 橙皮苷含量測定

2.2.1 溶液制備 對照品溶液 取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l ml含50 μg溶液，即得。

藥材對照溶液 取青皮對照藥材0.5 g，精密稱定，置入50 ml具塞量瓶，加入甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率40 Hz）20 min，放冷，用甲醇補足至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液 取利膽顆粒1.0 g，精密稱定，置入50 ml具塞量瓶，加入甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率40 Hz）20 min，放冷，用甲醇補足至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液 按1.2項下處方工藝制備不含青皮的陰性樣品，取1.0 g，精密稱定，置50 ml具塞量瓶，加入甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率40 Hz）20 min，放冷，用甲醇補足至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 ml，置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Shimadzu VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：283 nm。

表1 梯度洗脫時間表

2.2.3 專屬性試驗 分別精密吸取陰性對照溶液、對照藥材溶液、對照品溶液、供試品溶液各10 μl，按含量測定項下的方法進行測定。結(jié)果：供試品溶液和對照品溶液色譜圖上有一保留時間幾乎相同的特征峰，而陰性對照溶液在此保留時間橙皮苷出峰位置無吸收峰，表明輔料及其他組分不干擾橙皮苷的測定。

2.2.4 定量限 取橙皮苷對照品，用甲醇制成每1 ml中含3.996 μg溶液，取10 μl進樣，記錄色譜圖，按色譜峰信噪比（S/N）＝10作為定量限，最低可定量測定的濃度為3.996 μg/ml，定量限為0.03996 μg。

圖4 橙皮苷HPLC圖

2.2.5 儀器精密度試驗 取含量測定項下的橙皮苷對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，平均峰面積858.9132，計算RSD=0.305%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.6 線性關系的考察 精密稱取橙皮苷對照品10.40 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇適量溶解，定容至刻度，搖勻，作為橙皮苷對照品儲備液（0.1998 mg/m1）。精密量取對照品儲備液1.0，2.0，3.0，5.0 ml，分別置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，制成4份不同濃度的對照品溶液；精密吸取上述對照品溶液及儲備液各10 μl，分別注入高效液相色譜儀，按照含量測定項下的色譜條件測定，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y= 16 135X-7.8441，R2=0.9999。結(jié)果表明，橙皮苷在濃度19.98～199.8 μg/ml范圍內(nèi)進樣量與峰面積呈良好線性。

2.2.7 加樣回收試驗 稱取6份已知含量的樣品（橙皮苷含量為5.476 mg/g），每份0.5 g，分別精密加入3 ml橙皮苷對照品溶液（0.806 47 mg/ml），按2.2.1項下所述方法制備供試品溶液，2.2.2項下色譜條件進行含量測定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，平均回收率為97.41%，RSD為1.696%，結(jié)果符合要求。

表2 回收率試驗結(jié)果

2.2.8 重復性試驗 精密稱取供試品6份各1 g，按2.2.1項下的方法制成6份供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件進行測定。結(jié)果橙皮苷平均含量為5.4758 mg/g，RSD為1.40%，重復性試驗的相對標準偏差＜2%，符合試驗要求。

2.2.9 儀器精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，計算峰面積平均峰面積858.913，RSD為0.30%。儀器精密度試驗的RSD＜2%，符合試驗要求。

2.2.10 溶液穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液于室溫條件下放置，分別于0，1，2，4，8，12 h取出測定橙皮苷峰面積，計算平均峰面積為878.4155，RSD為0.83%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.11 樣品含量測定 根據(jù)上述建立的橙皮苷含量測定方法測定3批樣品，橙皮苷含量為5.2515，5.7799，5.6874 mg/g。

3 討論

篩選利膽顆粒中白芍TLC鑒別方法，展開劑分別采用了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2)[4]、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）、醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）[5]、乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（15:2:1:3）于10 ℃下放置過夜的上層溶液。結(jié)果表明以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-水（15:2:1:3）于10 ℃下放置過夜的上層溶液為展開劑顯色后主斑點更加清晰，各斑點間的分離度較佳。

在姜黃的TLC定性鑒別研究中，展開劑分別選用了三氯甲烷-甲醇-甲酸（96:4:0.7）[6]、二氯甲烷-甲醇-甲酸（96:4:0.7）、環(huán)己烷-丙酮（1:1）[7]、氯仿-甲醇-冰醋酸（96:3:1）[8]。結(jié)果表明，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（96:4:0.7）為展開劑顯色后主斑點更清晰；且只有在該展開劑條件下，姜黃對照藥材能呈現(xiàn)3個主成分的斑點。

在橙皮苷含量測定的研究中發(fā)現(xiàn)，由于橙皮苷具有雙氫黃酮氧苷結(jié)構(gòu)，呈弱酸性[9]，因此流動相的 pH 對分離有較大影響。流動相條件嘗試甲醇-0.1%磷酸（35:65）[10]、甲醇-冰乙酸-水（35:4:61）[11]、甲醇-冰乙酸-水（30:4:66）[12]甲醇-1%乙酸水溶液（50:50）[13]、但分離效果不佳，分離度偏低。改用乙腈磷酸系統(tǒng)，采用乙腈-0.2%磷酸20:80[14]、乙腈0.2%磷酸15:85以及梯度洗脫的液相條件。以分離度、峰形、保留時間作為評價指標，最終確定了2.2.2項下的梯度洗脫色譜條件，分離度遠高于其他條件。