不同架式‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)成熟期間單萜積累及相關(guān)基因的表達(dá)

王慧玲，王曉玥，閆愛玲，孫磊，張國軍，任建成，徐海英

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不同架式‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)成熟期間單萜積累及相關(guān)基因的表達(dá)

王慧玲1，王曉玥2，閆愛玲3，孫磊1，張國軍1，任建成1，徐海英1

（1北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093；2北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

【目的】探討不同架式對葡萄果實(shí)成熟期間單萜類化合物合成的影響，進(jìn)一步從基因表達(dá)水平揭示基因轉(zhuǎn)錄與單萜積累的關(guān)系，以期為生產(chǎn)中架式選擇及葡萄果實(shí)香味品質(zhì)的提高提供一定的理論依據(jù)。【方法】以T型和V型架式栽培的‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)為試材，于果實(shí)成熟初期（花后30 d）開始取樣，直至果實(shí)完全成熟。連續(xù)兩年常規(guī)方法測定果實(shí)樣品可溶性固形物及可滴定酸含量，利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPEME-GC-MS）測定果實(shí)中單萜類組分和含量的變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析單萜合成途徑中關(guān)鍵基因脫氧木酮糖磷酸合酶基因（和）、脫氧木酮糖磷酸還原異構(gòu)酶基因（）、異戊烯基焦磷酸還原酶基因（）、里那醇合成酶基因（）和萜品醇合成酶基因（）的表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】隨著果實(shí)成熟，可溶性固形物含量逐漸升高，而可滴定酸含量逐漸降低。成熟期的T型架葡萄果實(shí)可溶性固形物含量顯著高于V型架，可滴定酸含量沒有顯著差異。2016年和2017年兩種架式果實(shí)樣品中分別檢測到27和28種單萜類化合物。檢測結(jié)果表明不同架式主要萜烯類化合物組分不盡相同，隨著果實(shí)成熟，主要萜烯類成分也發(fā)生變化。成熟時(shí)，T型架果實(shí)中主要單萜類化合物有里那醇、檸檬烯、α-萜品醇、β-cis-羅勒烯和香葉醇；V型架主要有里那醇、α-萜品醇、檸檬烯、橙花醚和β-cis-羅勒烯等，其中以里那醇含量最高。2016年成熟期T型架果實(shí)單萜總量達(dá)到108.18 μg?L-1，是V型架最高含量的1.9倍。而2017年成熟期T型架果實(shí)單萜總量達(dá)到403.24 μg?L-1，是V型架最高含量的1.5倍；大多數(shù)單萜類化合物含量在成熟時(shí)表現(xiàn)為T型架顯著高于V型架。在整個(gè)果實(shí)成熟期間，兩種架式葡萄果實(shí)單萜類化合物積累表現(xiàn)為兩種變化模式，包括里那醇、香葉醇、橙花醇及萜品醇等在內(nèi)的大部分化合物遵循第一種模式，即在果實(shí)成熟時(shí)含量達(dá)到最高。但是不同架式表現(xiàn)又略微不同，(E,Z)-別羅勒烯、β-cis-羅勒烯、檸檬烯和α-萜品醇等化合物在T型架果實(shí)中表現(xiàn)為先下降，花后57 d急劇升高，成熟后期（花后76 d）又下降的趨勢。而在V型架果實(shí)中這些化合物含量隨著果實(shí)成熟逐漸上升，花后48 d達(dá)到積累高峰，之后又逐漸下降至最低含量。另外，果實(shí)成熟期間單萜合成途徑基因（、、、、和）表達(dá)量隨著果實(shí)成熟呈上升趨勢。不同架式葡萄果實(shí)成熟期間單萜總量積累規(guī)律與、、和表達(dá)規(guī)律相似。成熟期T型架果實(shí)中各個(gè)基因表達(dá)量明顯高于V型架，與單萜類化合物積累模式相一致?！窘Y(jié)論】T型架式栽培更有利于果實(shí)單萜類物質(zhì)的積累，T型架式單萜類化合物的高效積累與其代謝途徑多個(gè)關(guān)鍵酶基因高效表達(dá)密切相關(guān)。

葡萄；栽培架式；玫瑰香味；單萜

0 引言

【研究意義】香氣是衡量葡萄及葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，直接影響消費(fèi)者的認(rèn)可程度。特別是玫瑰香型的鮮食葡萄備受消費(fèi)者喜愛，玫瑰香味育種也一直是葡萄品質(zhì)研究和育種的重點(diǎn)。萜烯類化合物因具濃郁香味，感官閾值低，是玫瑰香味葡萄的典型香氣成分[1]。不同栽培架式結(jié)構(gòu)影響果際微生態(tài)條件和葉片的光合作用最終影響葡萄香氣積累[2]。‘愛神玫瑰’是極早熟無核鮮食葡萄新品種，具有典型的玫瑰香味[3]。探究不同栽培架式‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)發(fā)育中單萜化合物的積累模式，結(jié)合關(guān)鍵基因表達(dá)分析，可為闡明萜類物質(zhì)的生物合成及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而為葡萄香味品質(zhì)改善和栽培架式的選擇提供理論支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】單萜的合成途徑已經(jīng)較為清晰，主要是通過位于質(zhì)體中的脫氧-木酮糖-5-磷酸/甲基磷酸赤蘚糖途徑（DXP/MEP）合成[4]。影響果實(shí)萜類香氣合成積累的因素很多，除了品種基因組成等內(nèi)因外，還受生長環(huán)境及栽培技術(shù)措施等外因的影響[5-7]。在各種栽培措施中，栽培架式結(jié)構(gòu)對葉幕類型可以產(chǎn)生最重要的和直接的影響，葉幕結(jié)構(gòu)通過影響光能截留量影響葉際、果際微生態(tài)條件和葉片的光合作用，最終影響葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)[8]。關(guān)于架式對葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響已有較多的報(bào)道，但大多關(guān)注可溶性固形物、花色苷、總酚等不可揮發(fā)性物質(zhì)[9-12]，對于香氣成分研究較少。國內(nèi)僅有的2篇報(bào)道主要研究了‘玫瑰香’葡萄在不同架式下芳香物質(zhì)含量的變化。趙新節(jié)等[13]以7年生棚架和籬架栽培模式下的‘玫瑰香’葡萄為試材，研究發(fā)現(xiàn)籬架葡萄成熟后期酯類物質(zhì)相對含量高于棚架, 而酮醛類物質(zhì)和萜類物質(zhì)相對含量低于棚架；商佳胤等[14]研究發(fā)現(xiàn)Y型架栽培的‘玫瑰香’葡萄果實(shí)中芳香化合物種類和含量都較高，葡萄果實(shí)風(fēng)味優(yōu)于籬架。而國外研究者主要關(guān)注架式對釀酒葡萄及其釀造葡萄酒中香氣的影響。Ji和DamI[15]研究發(fā)現(xiàn)直立架式栽培的釀酒葡萄‘塔名內(nèi)’（Traminette）中積累的單萜類化合物特別是香葉醇含量更高。Fragasso等[16]研究了不同整形方式下‘普里米蒂沃’（Primitivo）葡萄及其釀造葡萄酒中揮發(fā)性成分的變化。【本研究切入點(diǎn)】目前的研究主要是針對籬架和棚架，且主要在香氣物質(zhì)成分分析層面，其合成調(diào)控機(jī)制還不清晰。關(guān)于不同架式（V型和T型）對鮮食葡萄果實(shí)成熟過程中玫瑰香味化合物合成的影響及可能調(diào)控機(jī)制的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以T型和V型架式栽培下的‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)為試材，探討兩種架式下葡萄成熟期間單萜類化合物積累及其合成途徑關(guān)鍵酶基因（、、、、、）的表達(dá)模式，以期為適宜架式選擇，為進(jìn)一步提高果實(shí)中萜類物質(zhì)的含量，改善果實(shí)玫瑰香味及闡明萜類物質(zhì)的生物合成和調(diào)控機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料及地點(diǎn)

試驗(yàn)材料為7年生早熟玫瑰香型葡萄‘愛神玫瑰’（cv. Aishen Meigui），定植于北京市平谷區(qū)馬昌營鎮(zhèn)（北緯40°13′，東經(jīng)117°12′），試驗(yàn)地土壤肥力中等，pH 6.9，有機(jī)質(zhì)含量12.50 g?kg-1，全氮0.86 g?kg-1，全磷0.87 g?kg-1，全鉀22.2 g?kg-1，可溶性鹽1.03 g?kg-1。試驗(yàn)進(jìn)行年份秋季溝施有機(jī)肥（1 t/667 m2），果實(shí)膨大期滴灌施肥（5 kg/667 m2）。栽培架式分為T型（順行平棚架）和V型，兩種架式的樹形均為順行水平龍干形，株行距1.5 m×3 m。兩種架式均種植兩行，各45株，2芽短枝修剪，每20 cm留一結(jié)果母枝，每個(gè)結(jié)果枝留2個(gè)果穗，豆果期疏去副穗和穗尖，保持單株產(chǎn)量一致。采用簡易避雨、地表園藝地布覆蓋、滴灌供水和常規(guī)病蟲害等管理模式，生長期內(nèi)修剪及肥水管理一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣 2016、2017年每年6—8月取樣。每種架式類型分為3個(gè)小區(qū)（30株/小區(qū)），葡萄果實(shí)從轉(zhuǎn)色初期（花后30 d）開始取樣，直至果實(shí)完全成熟。2016年分別于6月26日（花后30 d）、7月5日（花后39 d）、7月14日（花后48 d）、7月21日（花后57 d）、8月2日（花后67 d）和8月11日（花后76 d）取樣6次?；?016年試驗(yàn)數(shù)據(jù)，2017年于6月29日開始取樣（花后30 d），每隔9 d取樣一次，至8月4日（花后67 d）結(jié)束，共取樣5次。取樣時(shí)每個(gè)小區(qū)采集20穗（栽培行陰、陽面各取10穗），兼顧葉幕層內(nèi)、外和上、中、下果穗，采樣后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 可溶性固形物和可滴定酸測定 從采集的新鮮果實(shí)樣品中隨機(jī)取出50粒，擠出葡萄汁，分別測定可溶性固形物和可滴定酸?？扇苄怨绦挝锊捎檬殖质秸酃鈨xPAL-1（Atago Co，Tokyo，Japan）測定；可滴定酸采用0.1 mol?L-1NaOH進(jìn)行測定，含量以酒石酸表示，3次重復(fù)。

1.2.3 香氣化合物的提取和測定 香氣物質(zhì)的提取和測定參考Wen等[17]的方法略有改動。取50 g葡萄果實(shí)，液氮保護(hù)下打碎去籽，分別加入0.5 g D-葡萄糖酸內(nèi)酯和2 g聚乙烯基聚吡咯烷酮，利用研磨機(jī)（IKA A11）打磨成粉末，室溫靜置浸提，然后于4℃下8 500 r/min離心10 min，得到澄清葡萄汁。每個(gè)處理進(jìn)行3 次獨(dú)立的提取。取5 mL葡萄汁加入1.0 g NaCl和10 μL 4-甲基-2-戊醇，40℃加熱攪拌30 min后，用已活化或熱解析過的聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭相同溫度下吸附30 min，然后將萃取頭插入氣相色譜的進(jìn)樣口，250℃下熱解析8 min。

試驗(yàn)所用氣相色譜為安捷倫7890B，質(zhì)譜為5977A（Agilent，USA），色譜柱為HP-INNOWAX（長60 m，內(nèi)徑0.25 mm，液膜厚度0.25 μm）。載氣為高純氦氣，流速為1 mL?min-1。固相微萃取采用自動進(jìn)樣，不分流模式。柱溫箱的升溫程序?yàn)椋?0℃保持1 min，然后以3℃?min-1的速度升溫至220℃，保持5 min。質(zhì)譜接口溫度為280℃，離子源溫度為230℃，電離方式EI，離子能量70 ev，質(zhì)量掃描范圍為20—350 u。

根據(jù)已有化合物標(biāo)樣的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，參照NIST 05標(biāo)準(zhǔn)譜庫及相關(guān)文獻(xiàn)對樣品進(jìn)行定性分析；利用已有的化合物制備標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)利用化學(xué)結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.2.4 RNA提取和qPCR分析 采用植物RNA快速提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）提取葡萄果實(shí)的總RNA。然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，A3500），參照說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆?。熒光?shí)時(shí)定量qPCR反應(yīng)體系參照WEN等[17]的方法。在萜類生物合成途徑中的6個(gè)關(guān)鍵基因的引物序列參照孫磊等[18]的合成，使用、和3個(gè)內(nèi)參基因做為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用分析軟件SPSS 13.0，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性方差分析，最低顯著水平＜0.05；主成分分析和聚類分析采用MetaboAnalyst 4.0；繪圖采用Excel和Sigma Plot 10.0。

2 結(jié)果

2.1 不同架式葡萄果實(shí)成熟期間可滴定酸及可溶性固形物的變化

葡萄果實(shí)可溶性固形物含量在兩種栽培架式下均隨著果實(shí)成熟逐漸升高，可滴定酸含量逐漸降低（表1）。V型架栽培‘愛神玫瑰’葡萄在花后48 d可溶性固形物含量分別升至15.72%（2016年）和15.81%（2017年），可滴定酸含量分別降至4.06 g?L-1（2016年）和4.16 g?L-1（2017年），花后57 d可溶性固形物及可滴定酸含量均趨于穩(wěn)定，確定此時(shí)葡萄進(jìn)入成熟期。而T型架式栽培葡萄可溶性固形物含量在花后57 d分別上升至15.38%（2016年）和16.01%（2017年），在花后67 d含量升至最高，而可滴定酸降至較低水平。果實(shí)成熟后，T型架式栽培的葡萄果實(shí)可溶性固形物含量高于V型架，含酸量無顯著差異。

表1 不同架式果實(shí)成熟期間可滴定酸及可溶性固形物分析

不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different letters stand for the significant difference (＜0.05). The same as below

2.2 不同架式對葡萄果實(shí)中單萜類化合物組成的影響

利用SPEME-GC-MS方法，本研究2016年對28種游離態(tài)單萜類化合物進(jìn)行了定性定量分析（表2）。在兩種架式栽培‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)成熟過程中，異香葉醇在V型架葡萄果實(shí)成熟后期未檢測到，其余化合物均檢測到。在2017年對27種游離態(tài)單萜類化合物進(jìn)行了定性定量分析，所有化合物均檢測到（表2）。通過兩個(gè)年份化合物數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在葡萄果實(shí)成熟過程中，不同架式主要單萜組分差異顯著。成熟初期（花后30 d），T型架葡萄果實(shí)中含量最高的5個(gè)化合物依次為橙花醚（2016—2017年）、里那醇（2017年）、異松油烯（2017年）、β-cis-羅勒烯（2017年）、cis-呋喃型氧化里那醇（2016年）、檸檬烯（2016年）、α-萜品醇（2016年）和γ-松油烯（2016—2017年）等，5個(gè)化合物含量占單萜總含量的60%以上。而V型架葡萄果實(shí)中主要單萜類化合物包括橙花醚（2016—2017年）、里那醇（2016—2017年）、異松油烯（2017年）、α-萜品醇（2016年）、檸檬烯（2016—2017年）和β-香茅醇（2016年）?；ê?9 d，T型架栽培果實(shí)中里那醇含量迅速升高成為第二主要成分，V型架果實(shí)中香葉醇成為主要成分，橙花醚在兩種架式果實(shí)中含量仍然較高?；ê?8 d，兩年數(shù)據(jù)均顯示橙花醚、香葉醇、里那醇、α-萜品醇成為T型架果實(shí)中主含量萜類物質(zhì)；而V型架葡萄中里那醇含量最高，此外含量較高的還有香葉醇（2016—2017年）、檸檬烯（2016年）、α-萜品醇（2016—2017年）和β-cis-羅勒烯（2016年）。T型架果實(shí)在花后57 d主要單萜組成包括里那醇（2016—2017年）、橙花醇（2017年）、香葉醇（2017年）、檸檬烯（2016年）、橙花醚（2016年）、α-萜品醇（2016—2017年）和β-cis-羅勒烯（2016年），其中里那醇含量分別達(dá)到41.67 μg?L-1（2016年）和96.64 μg?L-1（2017年）；V型架果實(shí)主要單萜成分有橙花醚（2016—2017年）、里那醇（2016—2017年）、橙花醇（2017年）、香葉醇（2017年）、α-萜品醇（2016年）、檸檬烯（2016—2017年）和β-cis-羅勒烯?；ê?7 d，兩種架式果實(shí)中主要單萜類化合物組分變化較小，其中T型果實(shí)中主要是里那醇、檸檬烯、α-萜品醇、β-cis-羅勒烯和香葉醇，V型架栽培果實(shí)中主要有里那醇、香葉醇、檸檬烯、橙花醚等，2016年里那醇在兩種架式果實(shí)中含量最高，而在2017年香葉醇含量最高。

表2 不同架式葡萄果實(shí)成熟期間單萜含量分析

“tr”表示痕量；“nd”表示沒有檢測到

“tr” represents trace mount; “nd” represents not detected

2.3 不同架式對葡萄果實(shí)成熟期間單萜化合物含量的影響

2年化合物數(shù)據(jù)顯示不同架式單萜化合物總量差異顯著（表2）。轉(zhuǎn)色初期（花后30 d）到花后39 d，T型架栽培葡萄果實(shí)中單萜總量顯著高于V型架?；ê?8 d，V型架葡萄果實(shí)單萜總量分別升高達(dá)到58.4 μg·L-1（2016年）及260.9 μg·L-1（2017年），顯著高于T型葡萄果實(shí)單萜總量?；ê?7 d，T型架葡萄果實(shí)單萜含量迅速上升，遠(yuǎn)高于V型架。顯著性差異分析顯示，成熟期大多數(shù)單萜類化合物在T型架果實(shí)含量顯著高于V型架（表2）。

根據(jù)兩年化合物含量進(jìn)行聚類分析（圖1），不同架式‘愛神玫瑰’果實(shí)成熟期間游離態(tài)單萜含量變化主要表現(xiàn)兩種模式（紅色數(shù)字表示）。第一種模式包含(E,Z)-別羅勒烯（M11）、β-cis-羅勒烯（M6）、檸檬烯（M2）、β-trans-羅勒烯（M4）、別羅勒烯（M10）、異松油烯（M7）、α-萜品醇（M20）、香葉醇（M27）、里那醇（M16）、橙花醇（M24）、香葉醛（M21）、香葉酸（M28）和β-月桂烯（M1）等化合物，這一大類化合物大多數(shù)在果實(shí)成熟時(shí)含量達(dá)到最高。但是在不同架式表現(xiàn)又略微不同。(E,Z)-別羅勒烯（M11）、β-cis-羅勒烯（M6）、檸檬烯（M2）、β-trans-羅勒烯（M4）、別羅勒烯（M10）、異松油烯（M7）和α-萜品醇（M20）這7種化合物在T型架果實(shí)中表現(xiàn)為先下降，花后57 d急劇升高，成熟后期（花后76 d）又下降的趨勢。而在V型架果實(shí)中這7種化合物含量隨著果實(shí)成熟逐漸上升，花后48 d達(dá)到積累高峰，之后又逐漸下降至最低含量。香葉醇（M27）、里那醇（M16）、橙花醇（M24）、香葉醛（M21）、香葉酸（M28）和β-月桂烯（M1）等化合物則隨著果實(shí)成熟含量逐漸升高，到果實(shí)成熟期達(dá)到最高，到果實(shí)成熟后期（花后76 d）又有所下降。在第二種模式中，大多數(shù)化合物在成熟初期（花后30 d）含量最高，隨著果實(shí)成熟含量降低。在T型架果實(shí)中，這類化合物在花后48 d含量降至最低，隨著果實(shí)成熟又有所升高。而在V型架果實(shí)中化合物含量隨著成熟過程持續(xù)降低。這類化合物包括γ-松油烯（M5）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）、trans-呋喃型氧化里那醇（M13）、4-松油烯醇（M17）、水芹烯（M3）、β-香茅醇（M22）和香茅醛（M15）等。

此外，對兩年單萜化合物含量數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分和最小二乘判別分析，由結(jié)果可見（圖2，圖3），2016年前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為76.8%，而2017年前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為84.1%，均反映了所有化合物的絕大部分信息。根據(jù)兩個(gè)主成分可以把不同架式處理進(jìn)行很好的區(qū)分。最小二乘判別分析結(jié)果顯示VIP值大于1.0被認(rèn)為是主要貢獻(xiàn)差異化合物，由圖3可知，2016年VIP值較大的5個(gè)化合物依次為β-香茅醇（M22）、香葉醇（M27）、香葉酸（M28）、γ-松油烯（M5）、橙花醇（M24）和里那醇（M16）。2017年VIP值較大的5個(gè)化合物依次為4-松油烯醇（M17）、trans-氧化玫瑰（M9）、香葉醇（M27）、 γ-香葉醇（M23）和β-香茅醇（M22）。

2.4 不同架式栽培葡萄果實(shí)成熟期間單萜合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平變化

表達(dá)量在兩種架式葡萄果實(shí)中均從成熟初期（花后30 d）開始上升，T型架果實(shí)中在花后48 d表達(dá)量升至最高，隨后逐漸降低；而V型架在花后39 d達(dá)到表達(dá)高峰，隨后降低。T型架最高表達(dá)量顯著高于V型架，是V型架表達(dá)量的1.40倍。在兩種架式不同成熟時(shí)期葡萄果實(shí)中表達(dá)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，在T型架葡萄果實(shí)中，隨著果實(shí)成熟略有下降之后逐漸上升，至花后57 d達(dá)到表達(dá)高峰，之后又迅速下降。而對于V型架，隨著果實(shí)成熟，表達(dá)量逐漸上升，到花后48 d又有所下降，之后又逐漸上升。成熟期在T型架栽培果實(shí)中表達(dá)量高于V型架。在兩種架式葡萄果實(shí)成熟期間表達(dá)模式相似，都是先上升再下降，隨著果實(shí)成熟再次上升，至成熟后期又下降。在成熟期T型架葡萄果實(shí)表達(dá)量高于V型架。在兩種架式葡萄果實(shí)成熟期間表達(dá)模式不同，在T型架果實(shí)成熟過程中，表達(dá)量逐漸上升，至花后48 d表達(dá)量最高，之后逐漸降低；在V型架葡萄果實(shí)成熟過程中并沒有明顯的表達(dá)高峰。在T型架葡萄果實(shí)中表達(dá)量明顯高于V型架，轉(zhuǎn)色后表達(dá)量下降，隨后在花后57 d急劇上升至最高表達(dá)量。V型架葡萄果實(shí)中轉(zhuǎn)色后表達(dá)量同樣略有上升，之后有所下降，整體變化趨勢平緩。在兩種架式葡萄果實(shí)成熟過程中表達(dá)模式差異明顯，在T型架葡萄果實(shí)中，成熟初期（花后30 d）表達(dá)量最高，之后下降，至48 d后又略有上升；而對于V型架栽培葡萄果實(shí)，在花后48 d表達(dá)上升之后下降。

圖1 不同架式葡萄果實(shí)成熟期間單萜含量聚類分析

圖2 不同架式葡萄果實(shí)成熟期間單萜含量主成分分析

圖3 不同架式葡萄果實(shí)成熟期間基于VIP值的主要化合物

3 討論

栽培技術(shù)和栽培措施都與葡萄漿果品質(zhì)有著密切關(guān)系。適宜架式的選擇、架形改造和新式架型的應(yīng)用是提高葡萄果實(shí)品質(zhì)的重要舉施。研究表明不同架式對葡萄香氣物質(zhì)產(chǎn)生重要的影響[13-16]。本研究發(fā)現(xiàn)T型架栽培葡萄果實(shí)中萜類物質(zhì)含量更高，這可能是因?yàn)門型架栽培的相對光照強(qiáng)度高于V型架[19]，而光照有利于香氣物質(zhì)積累[1]。此外，兩種架式萜類化合物積累模式有差異。V型架葡萄果實(shí)萜類化合物積累高峰出現(xiàn)更早一些（花后48 d），T型架葡萄果實(shí)在花后57—67 d（圖1）。這可能與V型架葡萄果實(shí)更早進(jìn)入成熟期有關(guān)（表1）。陸貴峰等[19]也研究發(fā)現(xiàn)T型籬架栽培的‘凌豐’葡萄果實(shí)成熟期比V型籬架栽培晚3—5 d。隨著果實(shí)成熟，大部分萜類化合物含量逐漸升高。但是在果實(shí)成熟后期，兩種架式‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)中大部分萜類物質(zhì)均呈下降趨勢。有研究結(jié)果表明，‘瑞都香玉’葡萄主要呈香型萜烯成分里那醇、萜品醇含量在成熟期仍有增加，果實(shí)香氣成熟期稍晚于生理成熟期，適當(dāng)延遲采收有助于其特征香型的形成[20]，但是對于‘愛神玫瑰’葡萄延遲采收會導(dǎo)致玫瑰香味品質(zhì)降低，可能是由品種不同造成的差異。

圖4 同架式葡萄果實(shí)成熟期間單萜合成途徑基因表達(dá)變化

一般認(rèn)為玫瑰香型葡萄中主要呈香單萜類物質(zhì)為里那醇、香茅醇、橙花醇、萜品醇和香葉醇[21]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種架式葡萄果實(shí)中主要萜類化合物組分隨著果實(shí)發(fā)育發(fā)生變化（表2）。2016年在成熟期‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)中，主要單萜類成分有里那醇、α-萜品醇、香葉醇、檸檬烯、β-cis-羅勒烯、橙花醚和異松油烯，2017年主要有里那醇、α-萜品醇、香葉醇、橙花醇和-cis-羅勒烯，而香茅醇含量并不高。但是最小二乘判別分析結(jié)果顯示不同架式主要差異萜類化合物里包含β-香茅醇（M22）、香葉醇（M27）及氧化玫瑰等化合物，被認(rèn)為是主要貢獻(xiàn)萜類成分，可見化合物含量高低并不是玫瑰香味的主要決定因素。Ruiz-García等[22]指出氧化玫瑰存在與否可以作為鮮食葡萄玫瑰香味有無的評判標(biāo)準(zhǔn)，而氧化玫瑰含量很低。本研究結(jié)果表明兩個(gè)年份兩種架式成熟葡萄果實(shí)中里那醇含量均比較高，且高于其香氣閾值[17]，可能是‘愛神玫瑰’葡萄的主要呈香成分。

葡萄中單萜主要通過DXP/MEP途徑合成。本研究跟蹤了單萜合成途徑中6個(gè)重要基因的表達(dá)變化，各個(gè)基因表達(dá)量隨著果實(shí)成熟都有一個(gè)上升的過程（圖4）。不同架式葡萄果實(shí)成熟期間單萜總量積累規(guī)律與、、和表達(dá)規(guī)律相似。王繼源等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)‘陽光玫瑰’葡萄果實(shí)成熟過程中表達(dá)量上調(diào)促進(jìn)單萜物質(zhì)的生成。孫磊等[18]也發(fā)現(xiàn)在‘亞歷山大’葡萄果實(shí)發(fā)育過程中，單萜總量積累與和的轉(zhuǎn)錄情況具有顯著相關(guān)性，而與表達(dá)相關(guān)性較低，認(rèn)為果實(shí)后期萜類積累有可能是由于表達(dá)造成的。研究認(rèn)為葡萄對于玫瑰香味產(chǎn)生具有重要的作用，其基因序列的SNP突變是產(chǎn)生玫瑰香味的重要原因[25-27]，但是對于其表達(dá)關(guān)注比較少。本研究發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)成熟表達(dá)上調(diào)，而表達(dá)積累高峰早于，可能果實(shí)成熟早期單萜積累主要與表達(dá)有關(guān)。成熟期T型架果實(shí)中各個(gè)基因表達(dá)量明顯高于V型架（圖4），與單萜類化合物積累模式相一致。此外MARTIN等[28]用瓊瑤漿為材料的試驗(yàn)結(jié)果也證明的表達(dá)與單萜積累規(guī)律相一致。和的表達(dá)高峰與里那醇和萜品醇等產(chǎn)物積累略有差異，T型架和V型架果實(shí)中盡管隨著果實(shí)成熟表達(dá)上調(diào)，但是均在成熟初期（花后30 d）表達(dá)較高，而里那醇和萜品醇含量此時(shí)并不高，這可能與里那醇合成酶和萜品醇合酶還參與其他單萜化合物月桂烯、β-cis-羅勒烯和檸檬烯等合成有關(guān)[29-31]。T型架果實(shí)中表達(dá)量遠(yuǎn)高于V型架，這與里那醇等化合物積累相一致。除了花后48 d的果實(shí)，T型架果實(shí)中的表達(dá)也高于V型架，與化合物含量變化一致。

4 結(jié)論

單萜積累與其代謝途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)具有緊密相關(guān)性，其合成受到各個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。T型架式栽培‘愛神玫瑰’葡萄果實(shí)單萜類化合物積累更多。

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The Accumulation of Monoterpenes and the Expression of Its Biosynthesis Related Genes in ‘Aishen Meigui’ Grape Berries Cultivated in Different Trellis Systems During Ripening Stage

Wang Huiling1, Wang Xiaoyue2, Yan Ailing3,Sun Lei1, Zhang Guojun1,REN JianCheng1, Xu Haiying1

（1Beijing Academy of Forestry and Pomology Sciences, Beijing 100093;2Beijing Engineering Research Center for Deciduous Fruit Trees, Beijing 100097;3Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture, Beijing 100097）

【Objective】The effects of two trellis systems on the synthesis of monoterpenes and the expression of its biosynthesis related genes during the maturity of grape berries were studied, in order to reveal the relationship between gene transcription and monoterpenoids accumulation and provide a theoretical basis for trellis selection in production and improvement of aroma quality of grape fruits. 【Method】The grape berries of Aishen Meigui cultivated in the T and V trellis were used as materials. The berry samples were collected from the beginning of the color change period until the fruit ripened completely. Total soluble solid and titratable acid content in fruits were detected. The changes of monoterpene components and contents in fruits were determined by headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (SPEME-GC-MS) in two consecutive years. Additionally, the expression of key enzyme genes in monoterpene biosynthesis pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase genes (and), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase gene (), isopentenyl pyrophosphate reductase gene (), linalool synthase gene () and terpineol synthase gene () were analyzed by real-time fluorescence quantitative analysis (qPCR).【Result】During grape berries maturity, the total soluble solids content increased gradually, while titratable acid content decreased gradually. The total soluble solids content of the Aishen Meigui grape cultivated in T trellis was significantly higher than that of grape cultivated in V trellis at ripening stage, and there was no significant difference in titratable acid content.27 and 28 monoterpene compounds were detected in the grape berries of Aishen Meigui in 2016 and 2017, respectively. The main monoterpene components changed during berry maturity and were different in grape berries cultivated in T and V trellis. As the results shown, linalool, limonene, α-Terpineol, β-cis-Ocimene and geraniol were the main monoterpenes in grape berries cultivated in T trellis, while abundant linalool, α-Terpineol, limonene, nerol oxide and β-cis-Ocimene were detected in the berries cultivated in V trellis, and the content of linalool was the highest among them. At the maturity stage, total monoterpene content of T trellis grape berries reached 108.18 μg?L-1, which was 1.9 times higher than that of V trellis berries in 2016. While in 2017, total monoterpene content of T trellis grape berries reached 403.24 μg?L-1, which was 1.5 times higher than that of V trellis berries. The content of most monoterpene compounds in T trellis fruits were significantly higher than that in V trellis fruits at maturity. During grape berry development, the changes of monoterpenes accumulation in grape berries cultivated in both two trellis systems exhibited two patterns. Most of the monoterpenes including linalool, geraniol, nerol and α-Terpineol followed the first pattern: the content of monoterpenes reached the peak at maturity. But differences were observed between trellises. In the T trellis fruits, the content of compounds, such as (E,Z)-Allo-Ocimene, β-cis-Ocimene, limonene and α-terpineol, firstly decreased, and then increased sharply at 57 days after flowering, followed by a reduction during the later part of ripening stage (76 days after flowering). However, in V trellis berries, the content of these compounds increased gradually during fruit ripening, peaked at 48 days after flowering, and then decreased to the lowest level. The expression of monoterpene synthesis pathway genes (,,,,and) increased with berry ripening, of them, the changes of,,andexpression were corresponding well to the total monoterpenes accumulation patterns in grape berries cultivated in distinct trellis systems during ripening. The expression of each gene in T-trellis grape berries was significantly higher than that in V-trellis berries, which was consistent with the accumulation pattern of different monoterpenes. 【Conclusion】More accumulation of monoterpenes were detected in Aishen Meigui grape berries cultivated in T trellis. The synthesis of monoterpenes was highly correlated with the expression level of several key genes in the synthesis pathway.

grape; trellis systems; muscat flavor; monoterpenes

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.002

2018-09-14；

2019-01-11

國家自然科學(xué)基金青年基金（31601712）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-29）、北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科學(xué)基金（QNJJ201604）、北京市自然科學(xué)基金（6182007）

王慧玲，E-mail：wanghui198216@126.com。通信作者徐海英，Tel：010-82592156；E-mail：haiyingxu63@sina.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）