不同糖源對(duì)葡萄試管苗蛋白激酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

梁國平，李文芳，陳佰鴻，左存武，馬麗娟，何紅紅，萬鵬，安澤山，毛娟

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不同糖源對(duì)葡萄試管苗蛋白激酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

梁國平，李文芳，陳佰鴻，左存武，馬麗娟，何紅紅，萬鵬，安澤山，毛娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，蘭州 730070）

【目的】探究不同外源糖對(duì)葡萄試管苗生長發(fā)育及蛋白激酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序挖掘蛋白質(zhì)磷酸化過程中的基因,為葡萄蛋白激酶相關(guān)基因功能的驗(yàn)證奠定一定基礎(chǔ)。【方法】在基本培養(yǎng)基中分別添加2%的蔗糖、葡萄糖和果糖，以無糖為對(duì)照,分別命名為S20、G20、F20和CK，經(jīng)過37 d培養(yǎng)后，測定不同處理的地上和地下鮮重，并采用Illumina HiSeqTM2000對(duì)各處理葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過綜合生物信息學(xué)分析（參考基因組比對(duì)、差異基因（DEGs）篩選、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）注釋、GO（Gene Ontology）注釋等）篩選出蛋白激酶相關(guān)基因，通過qRT-PCR分析該蛋白激酶相關(guān)基因的表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】F20、G20和S20處理下的葡萄（‘紅地球’）試管苗與CK相比，地上鮮重具有明顯差異，且F20最高，而G20地下鮮重最高。SNP統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換是主要的變異類型，顛換次之，且發(fā)生在基因間區(qū)的SNP數(shù)量最多，其次是下游；剪接位點(diǎn)供體和同義終止發(fā)生的基因數(shù)量最少且相等。4個(gè)樣品中共獲得了2 633個(gè)差異基因，3個(gè)處理與CK相比，共有差異基因180個(gè)且被聚類為3組，第一組中127個(gè)基因僅在CK中高表達(dá)，第二組19個(gè)基因僅在G20下高表達(dá)，而第三組34個(gè)基因在3個(gè)處理下表達(dá)模式不盡相同。這些共有的差異基因在COG中注釋到了26個(gè)基因并分在11個(gè)功能類別中，且主要注釋在一般的功能類別中。在GO分類中，共有的基因分別被注釋在分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分的14、22和13個(gè)功能類別中。共篩選出7種蛋白激酶，分別為葡萄糖激酶（Glucokinase，GK）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、鈣調(diào)蛋白激酶（Calcineurin protein kinase，CBL）、蛋白磷酸酶2（Protein phosphatase 2，PP2A）、己糖激酶（Hexokinase，HXK）、組氨酸蛋白激酶（Histidine protein kinase，HPK）和酪氨酸激酶（Tyrosine kinase，TK），其不同激酶的基因在不同處理中具有各自的表達(dá)模式，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，選擇的20個(gè)差異基因中有17個(gè)基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致?！窘Y(jié)論】在葡萄試管苗培養(yǎng)中，果糖較葡萄糖和蔗糖相比對(duì)生長較好。測序得出180個(gè)差異基因?qū)?種不同糖均作出響應(yīng)，這些基因在COG數(shù)據(jù)庫中主要富集在膜酯轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、次級(jí)代謝物和碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解；GO中大多注釋在蛋白激酶和氧化還原酶的活性中；篩選出了7種蛋白激酶，這些差異基因在數(shù)量、功能分類和代謝通路上對(duì)糖的響應(yīng)各不相同。

RNA-Seq；外源糖；蛋白激酶；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

0 引言

【研究意義】在植物組織培養(yǎng)過程中，糖不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，以維持水分平衡[1]，而且還是組培植物能量的供應(yīng)者[2]和信號(hào)分子[3]。SOLAROVA等[4]指出，糖是初期組培苗幼芽生長和葉片光合作用所必須的。在葡萄良種繁育和脫毒苗培育過程中，糖對(duì)試管苗的形態(tài)建成具有決定性作用[5]。然而，在常規(guī)培養(yǎng)過程中，試管苗處在自養(yǎng)與異養(yǎng)的混合狀態(tài)[6]，且不同外源糖的供應(yīng)對(duì)試管苗的生長也具有不同的作用。蛋白激酶可將ATP分子上γ位的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移并共價(jià)結(jié)合到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸或絡(luò)氨酸）上，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)磷酸化并引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)的活性和功能，最終對(duì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程起到開關(guān)作用[7]。因此，通過轉(zhuǎn)錄組測序深入分析不同外源糖對(duì)葡萄試管苗生長發(fā)育的調(diào)控，特別是對(duì)蛋白激酶基因表達(dá)的影響，為在組培條件下深入了解糖對(duì)植株的形態(tài)建成和進(jìn)一步優(yōu)化碳源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生不定根的過程中，培養(yǎng)基的初始糖濃度對(duì)其生長有很大影響，低濃度糖難以滿足植物生長的需要，而高濃度糖則導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓過高，最終對(duì)不定根的生長產(chǎn)生抑制[8]。鄒英寧[9]在培養(yǎng)基中分別添加蔗糖、葡萄糖、山梨醇、果糖4種糖源對(duì)中國李進(jìn)行誘導(dǎo)增殖的研究中得出，葡萄糖濃度為30 g·L-1和15 g·L-1對(duì)促進(jìn)增殖及生長和生根率及生根倍數(shù)最好。在誘導(dǎo)白樺愈傷組織的過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中分別添加20—30 g·L-1的蔗糖、葡萄糖和果糖后，其鮮重積累量均顯著高于對(duì)照[10]。王思瑤等[11]研究了不同外源糖對(duì)檉柳叢生芽生長的影響，蔗糖濃度為10 g·L-1時(shí)有助于其叢生芽的生長。然而，KOZAI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，將含有一片葉的單芽莖段葡萄試管苗繼代在無糖培養(yǎng)基中也可生長。這些結(jié)果表明，不同外源糖對(duì)組培植物的生長發(fā)育具有不同的作用，且目的不同需求糖的種類也不盡相同。植物蛋白激酶在信號(hào)感知、傳導(dǎo)、生長發(fā)育以及基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。葡萄糖激酶（Glucokinase，GK）對(duì)葡萄糖具有特異性，在水稻[13]、豌豆[14]和馬鈴薯[15]中研究發(fā)現(xiàn)，該酶可優(yōu)先磷酸化葡萄糖，從而提前進(jìn)入糖酵解途徑。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）是一種絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，它介導(dǎo)多種生物和非生物脅迫的相關(guān)信號(hào)通路，以磷酸化方式實(shí)現(xiàn)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大，最后引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)植物的生長發(fā)育起重要的調(diào)控作用[16]。類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白作為（Calcineurin B-like protein，CBL）Ca2+傳感蛋白之一[17]，以絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）作為靶蛋白[18-19]，并形成蛋白激酶復(fù)合物CBL-CIPK，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來維持細(xì)胞離子平衡[20]。在擬南芥突變體中研究發(fā)現(xiàn)，CBL-CIPK信號(hào)通路參與調(diào)控鹽脅迫下Na+穩(wěn)態(tài)分布和Na+、K+平衡[21]。蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2，PP2A）包含一系列絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶[22]，該家族從酵母到哺乳動(dòng)物在功能和結(jié)構(gòu)上較為保守，并且在調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能中起關(guān)鍵作用[23]。己糖激酶（Hexokinase，HXK）催化己糖磷酸化并使之參與糖酵解[24]。KARVE等[25]用RT-PCR法研究擬南芥HXK基因中不同家族成員在6種器官（幼葉、成熟葉、根、花、角果和莖）的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在所有器官中都具有較高的豐度；在葉中高表達(dá)，但在庫組織中表達(dá)略低。在根和角果中豐度高，但低于。和表達(dá)量低于，且這兩者在不同器官中表達(dá)豐度相近，僅在花中有表達(dá)。組氨酸蛋白激酶（Histidine protein kinase，HPK）是一個(gè)磷酸化組氨酸保守殘基的信號(hào)傳導(dǎo)酶家族[26]，與它們的下游靶蛋白一起構(gòu)成了雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，響應(yīng)各種生物和非生物脅迫[27]。酪氨酸激酶（Tyrosinekinase，TK）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最為重要的物質(zhì)之一，對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)、通訊和發(fā)育生物學(xué)方面具有重要的意義。在動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn)，該酶的活性過高會(huì)導(dǎo)致其下游信號(hào)途徑激活，從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、對(duì)抗細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞生存，形成非正常組織[28]，而植物中報(bào)道甚少。【本研究切入點(diǎn)】雖然前人已在組培中對(duì)碳源影響植物生長發(fā)育方面做了大量報(bào)道，目的是確定最適碳源和濃度，以達(dá)到商品化生產(chǎn)和降低組培成本，然而在分子水平研究不同外源糖對(duì)其生長的影響，特別是對(duì)蛋白磷酸化中基因表達(dá)的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用高通量測序手段，在分子層面深入分析在不同外源糖條件下‘紅地球’葡萄（L Red Globe）試管苗葉片中轉(zhuǎn)錄本的變化，特別是蛋白激酶相關(guān)基因如何響應(yīng)不同的外源糖，為研究糖對(duì)植物生長發(fā)育的調(diào)控奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本試驗(yàn)于2016—2017年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的‘紅地球’試管苗。

選擇繼代健壯、長勢一致且無污染的試管苗，剪成單芽莖段（2—3 cm）并留一片葉，接種在不含糖以及含2%不同外源糖的50 mL MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基分裝在150 mL的三角瓶中，每瓶接1個(gè)外植體，外源糖分別為蔗糖、葡萄糖和果糖，以無糖為對(duì)照，基本培養(yǎng)基組分為：4.43 g·L-1MS+6 g·L-1瓊脂+0.2 mg·L-1IAA，pH為5.8—6.0，分別命名為CK、S20、G20和F20，每個(gè)處理接種30瓶，培養(yǎng)條件為（25±1）℃，白熾光36 mmol·m-2·s-1光照16 h，黑暗8 h。經(jīng)過37 d培養(yǎng)后，每個(gè)處理隨機(jī)挑選9瓶長勢一致的試管苗，測定其生物量，并迅速收集葉片液氮速凍，-80℃保存用于RNA的提取。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 生物量測定

將培養(yǎng)37 d后的試管苗從培養(yǎng)基中取出，不損傷根系，從基部第一個(gè)芽處剪斷，測定其地上鮮重。用蒸餾水將根系表面的培養(yǎng)基洗干凈，后將根系在濾紙上輕輕滾動(dòng)一圈，吸干表面多余水分，用于測定其地下鮮重，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 RNA提取和質(zhì)檢

RNA提取采用植物提取試劑盒（中科泰瑞生物技術(shù)有限公司，北京）并按操作說明書進(jìn)行。用Nanodrop和Agilent 2100（安捷倫有限責(zé)任公司，美國）檢測RNA的純度、濃度及完整性。

1.4 cDNA文庫的構(gòu)建

cDNA文庫構(gòu)建參照本課題組前期的試驗(yàn)方案進(jìn)行[29]。樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠，通過A-T互補(bǔ)配對(duì)與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集mRNA。隨后加入Fragmentation Buffer將mRNA打斷成短的片段。以打斷的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，隨后利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫。

1.5 cDNA庫檢及測序

文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫插入片段的長度進(jìn)行檢測，插入片段大小符合預(yù)期后，使用qPCR方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度＞2 nmol·L-1）。

庫檢合格后，采用Illumina HiseqTM2000進(jìn)行測序，測序讀長為PE100。

1.6 測序數(shù)據(jù)過濾

去除帶測序接頭的reads、無法確定堿基信息的比 例大于10%的reads及低質(zhì)量reads（Qphred≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read長度50%以上的reads）。

1.7 參考序列比對(duì)分析

利用TopHat將Clean Reads與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)[30]，獲取在參考基因組或基因上的位置信息以及測序樣品特有的序列特征信息。

1.8 差異基因篩選

通過設(shè)定FDR（False discovery rate）＜0.01和∣Log2（FC）∣≥2作為篩選差異基因的閾值進(jìn)行差異基因的篩選[31]。

1.9 qPCR驗(yàn)證

用差異基因的Gene ID對(duì)葡萄數(shù)據(jù)庫（http://www. genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）檢索并獲得相應(yīng)的CDS區(qū)，通過在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3 Input（http://primer3.ut.ee/）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物見表1。對(duì)1.3的RAN使用Primer ScriptTMRT regent Kit with gDNA Eeaser（TaKaRa）試劑盒并按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并用SYBR Primer Ex TaqTMII（TaKaRa）試劑盒說明書進(jìn)行定量，定量PCR儀為Light Cycler? 96 Real-Time PCR System（Roche，瑞士）。內(nèi)參基因?yàn)椋℅enBank accession no. CB973647）。引物由生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算[32]。

2.0 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010整理，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素ANOVO的Duncan’s法，顯著性水平為＜0.05，用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同外源糖對(duì)葡萄試管苗生長量的影響

以CK為對(duì)照，在2%的不同外源糖處理下，葡萄試管苗經(jīng)37 d培養(yǎng)后，地上和地下生長具有明顯差異。其中地上鮮重表現(xiàn)出顯著差異，且在F20下生物量最大，而S20和G20處理下無顯著變化。地下的鮮重在S20和G20下沒有顯著差異，而F20與兩個(gè)處理均表現(xiàn)出顯著差異（圖1-A、B）。

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)4個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測序共獲得21.53 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到4.69 Gb，不同處理獲得的Clean reads分別是：CK為19 840 139條，S20為19 619 720條，G20為24 923 975條和F20為20 579 635條。Q30堿基百分比均在90.26%以上（表2）。表明測序質(zhì)量較好，可以用于后期的數(shù)據(jù)分析。

2.3 SNP/InDel分析

SNP是個(gè)體基因組DNA同一位置單個(gè)核苷酸變異（轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失）所引起的多態(tài)性。對(duì)不同外源糖處理葡萄測序結(jié)果的單個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表3），4個(gè)樣品的SNP數(shù)量分別為：403 332、489 805、358 014和331 527個(gè)，且主要發(fā)生的變異類型是轉(zhuǎn)換，其頻率在65.89%—67.18%，而顛換頻率在32.82%—34.11%。進(jìn)一步對(duì)不同的SNP事件數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明發(fā)生在基因間區(qū)的SNP數(shù)量最多，為238 351個(gè)；其次是發(fā)生在下游的，為42 382個(gè)；而剪接位點(diǎn)供體和同義終止發(fā)生最少，且相等。（圖2）。

不同小寫字母表示不同糖處理水平上差異顯著（P＜0.05）。下同

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

表3 SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

圖2 SNP注釋分析

通過InDel注釋分類，結(jié)果如圖3所示。2%的不同外源糖處理‘紅地球’測序結(jié)果與參考基因組比對(duì)后，共獲得15種InDel類型，有21 479個(gè)差異表達(dá)基因的InDel類型為其他類型，而發(fā)生在基因間區(qū)的數(shù)量最多，為16 824個(gè)，其次是在下游，為3 343個(gè)；密碼子改變與缺失、終止獲得及剪接位點(diǎn)受體這3類事件的數(shù)量最少，都為1個(gè)。

2.4 可變剪接事件分析

對(duì)每個(gè)樣品存在的可變剪接類型統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示。不同外源糖處理下的葡萄試管苗中，其第一個(gè)外顯子可變剪接和最后一個(gè)外顯子可變剪接事件數(shù)量最多，其次是單內(nèi)含子滯留，而多外顯子跳躍（模糊邊界）和單外顯子跳躍（模糊邊界）事件數(shù)量最少。

2.5 差異基因表達(dá)分析

通過設(shè)定FDR和Log2（FC）兩個(gè)閾值對(duì)不同外源糖處理的葡萄試管苗測序結(jié)果進(jìn)行差異基因篩選，共獲得2 633個(gè)差異基因，其中共有的差異基因?yàn)?80個(gè)（圖5-A）。對(duì)共有的差異基因以Log2（FPKM）值進(jìn)行表達(dá)量分析（圖5-B），所有基因被聚類為3組，第一組包括127個(gè)基因，僅CK中高表達(dá)，而其余處理下均下調(diào)表達(dá)；第二組包括19個(gè)基因，僅在G20下高表達(dá)，其余處理中均下調(diào)；第三組的34個(gè)基因，與CK相比表達(dá)模式不盡一致，且表達(dá)在處理之間具有明顯差異。

圖3 InDel注釋分析

圖4 可變剪接分析

2.6 差異基因的COG分析

將共有的180個(gè)差異基因進(jìn)行COG注釋，結(jié)果僅注釋到了26個(gè)，包括6個(gè)上調(diào)基因和20個(gè)下調(diào)基因（圖6）。其中，注釋到一般功能預(yù)測的差異基因數(shù)量最多，為10個(gè)，其次是次級(jí)代謝物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解，包括4個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào)差異基因。在轉(zhuǎn)錄，能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶和防御機(jī)制4個(gè)功能分類中各注釋到1個(gè)基因。

圖5 差異基因的Venn圖和共有差異基因的表達(dá)分析

圖6 差異基因COG分析

2.7 差異基因的GO富集分析

通過對(duì)共有的差異基因進(jìn)行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要被注釋在分子功能（14）、生物學(xué)過程（22）和細(xì)胞組分（13）功能類別中（圖7）。在分子功能中，注釋在ATP結(jié)合（ATP binding (GO: 0005524)）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性（protein serine/threonine kinase activity (GO: 0004674)）和氧化還原酶活性（oxidoreductase activity (GO: 0016491)）的基因數(shù)量最多；生物學(xué)過程中，注釋在蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation (GO: 0006468)）、氧化還原過程（oxidation-reduction process (GO: 0055114)）和碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolic process (GO: 0005975)）的基因個(gè)數(shù)分別為23、20和10個(gè)，而在細(xì)胞組分中，細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region (GO: 0005576)）、質(zhì)膜（plasma membrane (GO: 0005886)）占比最高。在分子功能中也注釋到了蛋白激酶活性（protein kinase activity (GO: 0004672)）、6-磷酸果糖激酶活性（6-phosphofructokinase activity (GO: 0003872)）和生長因子激活（growth factor activity (GO: 0008083)）等。生物學(xué)過程中也注釋到了負(fù)調(diào)控細(xì)胞程序性死亡（negative regulation of programmed cell death (GO: 0043069)）、果糖6-磷酸代謝過程（fructose 6-phosphate metabolic process (GO: 0006002)）及生長發(fā)育等（developmental growth (GO: 0048589)）功能類別。

2.8 7個(gè)蛋白激酶差異基因表達(dá)

蛋白激酶對(duì)植物的生長具有重要的作用。通過對(duì)本次測序結(jié)果進(jìn)行篩選，獲得了7種與植物生長發(fā)育相關(guān)的蛋白激酶基因，包括GK的2個(gè)基因、MAPKs的34個(gè)基因、CBL的6個(gè)基因、PP2A的6個(gè)基因、HXK的6個(gè)基因、HPK的14個(gè)基因和TK的164個(gè)基因（圖8-A—G，G圖基因名稱見電子版附件）。與CK相比，2個(gè)GK基因在S20處理中上調(diào)表達(dá)（圖8-A）。MAPKs中的、、、、和在CK中上調(diào)表達(dá)，而在其余處理中均下調(diào)表達(dá)，S20下的4個(gè)基因包括、、和較CK、G20和F20表達(dá)量高（圖8-B）。CBL中的分別在CK和S20中出現(xiàn)下調(diào)，而在S20和F20中均上調(diào)表達(dá)（圖8-C）。有5個(gè)PP2A，包括、、、及僅在G20中上調(diào)表達(dá)，其余處理下均出現(xiàn)下調(diào)（圖8-D）。在HXK中，與CK相比在S20中僅有和為下調(diào)表達(dá)，其余的4個(gè)基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá)（圖8-E）。在HPK中，僅在CK中高表達(dá)，而在S20、G20和F20中出現(xiàn)低表達(dá)，、、、和只在S20中上調(diào)，而、、、和只在G20中上調(diào)（圖8-F）。TK的164個(gè)基因在不同的處理中，表達(dá)具有明顯差異（圖8-G）。

2.9 qRT-PCR驗(yàn)證

選擇了20個(gè)差異基因包括MAPK（5個(gè)）、HXK（1個(gè)）、PP2A（4個(gè)）、HPK（2個(gè)）和TK（8個(gè)）進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果如圖9所示。有3個(gè)基因分別為GSVIVG01015297001（）GSVIVG01009192001（）和GSVIVG01014110001（）在不同的外源糖處理下，表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)不一致，其余的17個(gè)基因基本一致，表明測序結(jié)果可靠。

3 討論

糖對(duì)植物的形態(tài)建成和基因表達(dá)調(diào)控是其代謝產(chǎn)生的效應(yīng)。近年來研究表明，糖作為信號(hào)分子在胞內(nèi)形成不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核或細(xì)胞器中目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上，控制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，引起相應(yīng)的生理生化變化，從而調(diào)控植物的生長和發(fā)育[33]。本次測序共獲得21.53 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到4.69 Gb。對(duì)SNP統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，獲得轉(zhuǎn)換和顛換的SNP覆蓋率分別為65.89%—67.18%和32.82%—34.11%不等。在注釋到的15種InDel類型中，除21 479個(gè)差異基因的InDel類型未知外，最多的是發(fā)生在基因間區(qū)和下游中，獲得終止、密碼子改變與缺失和剪接位點(diǎn)受體這三類事件的數(shù)量最少，均為1個(gè)差異基因?？勺兗艚幽軌蚴挂粋€(gè)轉(zhuǎn)錄單位形成多個(gè)轉(zhuǎn)錄本和蛋白同系物，從而增加轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，這是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因[34]。對(duì)本次測序結(jié)果進(jìn)行可變剪接分析得出，12種可變剪接事件中TTS和TSS數(shù)量最多，其次是IR，而MSKIP和XMSKIP事件最少。

進(jìn)行COG注釋，可從基因組水平上尋找直系同源體，預(yù)測未知的ORF生物學(xué)功能，并提高基因注釋的準(zhǔn)確性和完整性[35]。對(duì)篩選出的180個(gè)共有的差異基因通過COG注釋，共獲得了26個(gè)基因，包括6個(gè)下調(diào)和20個(gè)上調(diào)，且注釋到最多的是一般功能預(yù)測，而轉(zhuǎn)錄相關(guān)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制功能類別次之，最少的則是核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和染色體結(jié)構(gòu)與活力，在細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外結(jié)構(gòu)中均沒有注釋到差異基因，這一結(jié)果與張雪等[36]研究山葡萄果皮著色的轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)植物生長發(fā)育和果實(shí)著色的調(diào)控具有重要作用。GO注釋分類發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要被注釋在分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分的12、22和13個(gè)功能類別中。在分子功能中，注釋到絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的基因數(shù)量較多，其次是氧化還原酶活性；在生物學(xué)過程中，注釋到蛋白質(zhì)磷酸化、氧化還原過程和碳水化合物代謝過程的基因個(gè)數(shù)分別為21、20和7個(gè)，而在細(xì)胞組分中，細(xì)胞外區(qū)域和質(zhì)膜占比最高，達(dá)到11.2%和5.6%，這一結(jié)果與魏利斌等[37]在研究芝麻發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

大量研究表明蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程在細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，它是生物體中普遍存在的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，幾乎涉及所有的生理和病理過程，如糖代謝、細(xì)胞的生長發(fā)育、光合作用、基因表達(dá)等[38]。本研究通過設(shè)定差異基因閾值，篩選出了與植物生長發(fā)育相關(guān)的7種蛋白激酶，包括GKs、MAPKs、CBLs、PP2A、HXK、HPK和TK，這些蛋白激酶基因在不同外源糖處理下表達(dá)各不相同。

GKs能催化葡萄糖和其他己糖的磷酸化，包括果糖、甘露醇和半乳糖，也在大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物和植物中充當(dāng)信號(hào)感受器[39-40]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，與線粒體胞膜相關(guān)的HXK1感知葡萄糖存在后，會(huì)特異性地下調(diào)編碼與光合作用過程中相關(guān)蛋白質(zhì)基因的表達(dá)，例如Chl a/b結(jié)合蛋白（CAB）和Rubisco小亞基（RBCS）等[41-42]。在本研究中，GK中的兩個(gè)基因在S20處理中上調(diào)表達(dá)，在G20處理中下調(diào)，這一結(jié)果與CHO等[43]的研究一致。HXK作為雙功能酶存在于所有的有機(jī)體中，它不僅磷酸化己糖轉(zhuǎn)變?yōu)榧禾?磷酸，而且對(duì)糖信號(hào)的感知具有重要作用[44]。對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行HXK篩選得出，G20下分別有兩個(gè)和與其余3個(gè)處理相比均上調(diào)表達(dá)，表明這幾個(gè)基因較其余的處理更能快速感應(yīng)葡萄糖的存在。

PP2A在植物中具有多重作用，例如對(duì)細(xì)胞周期性進(jìn)程的調(diào)控，根皮質(zhì)細(xì)胞伸長，組織發(fā)育和植物對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)等[45]。RAZAVIZADEH等[46]研究發(fā)現(xiàn)，在不同程度的干旱脅迫和4 μmol·L-1的ABA處理下均表現(xiàn)出顯著上調(diào)。本研究中對(duì)PP2A進(jìn)行差異基因篩選，獲得6個(gè)差異表達(dá)基因，其中、、、及僅在G20中上調(diào)表達(dá)，其余處理均出現(xiàn)下調(diào)，且與對(duì)照相比，在果糖中出現(xiàn)上調(diào)趨勢。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，CIPK9與CBL3相互作用有助于在低K+脅迫下細(xì)胞K+的動(dòng)態(tài)平衡，且CBL2和CBL3的過表達(dá)提高了對(duì)低K+的敏感性[47]，而本研究篩選到的6個(gè)CBL中，、和在G20下低表達(dá)，另一個(gè)、和卻表現(xiàn)出上調(diào)，表明這些基因在響應(yīng)不同的外源糖時(shí)表達(dá)模式不盡相同。

在植物中，由環(huán)境條件或激素改變產(chǎn)生的信號(hào)均是通過MAPKs所介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行傳遞的[48]。通過遺傳和生化方法研究發(fā)現(xiàn)，MAPKs不僅參與生物和非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且還參與激素對(duì)生長發(fā)育信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[49]。如今，MAPKs已在大量植物物種中被發(fā)現(xiàn)，表明MAPKs級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在高等植物中也非常保守[50]。通過轉(zhuǎn)錄組測序，本研究篩選到了MAPKs的34個(gè)差異表達(dá)基因，其中、、、、和在CK中上調(diào)表達(dá)，而在其余處理下均下調(diào)表達(dá)。HPKs是一個(gè)大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶家族，能夠在保守的組氨酸殘基上自磷酸，并與其下游的靶蛋白形成雙組分信號(hào)系統(tǒng)響應(yīng)生物和非生物脅迫[51]。本研究篩選到了10個(gè)組氨酸蛋白激酶基因，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，、、、和只在S20中上調(diào)，而、、、和只在G20中上調(diào)，表明這些基因?qū)憫?yīng)不同的糖具有明顯選擇性。酪氨酸（Tyr）磷酸化是動(dòng)物體內(nèi)受體酪氨酸激酶（RTKs）介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子開關(guān)[52]，在植物中雖然缺乏典型的RTKs，但是擁有數(shù)百個(gè)與動(dòng)物具有相似結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的RTKs[53]。最近研究表明，在植物中酪氨酸磷酸化對(duì)于調(diào)控誘導(dǎo)免疫過程（PTI）的信號(hào)傳遞具有重要作用[54]。本研究篩選到酪氨酸蛋白激酶的164個(gè)差異基因，這些基因在響應(yīng)不同的外源糖時(shí)具有各自的表達(dá)模式。

應(yīng)用qRT-PCR對(duì)測序結(jié)果挑選了20個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有17個(gè)基因的表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠，這為通過基因表達(dá)研究蛋白激酶響應(yīng)不同外源糖，并深入分析糖在植物生長發(fā)育中的作用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)不同外源糖處理下的葡萄試管苗進(jìn)行測序分析，共獲得了2 633個(gè)差異基因，有180個(gè)差異基因?qū)?種不同外源糖都作出響應(yīng)，且共有的這些基因表達(dá)對(duì)糖源具有選擇性。篩選到了7種蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)的基因，這些差異基因在數(shù)量、功能分類和代謝通路上對(duì)糖的響應(yīng)各不相同，且有各自的選擇表達(dá)特異性，為豐富糖在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及進(jìn)一步探究蛋白質(zhì)磷酸化響應(yīng)外源糖提供了參考。

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Effects of Different Sugar Sources on Protein Kinase Gene Expression in Grape Plantlets

LIANG GuoPing, LI WenFang, CHEN BaiHong, ZUO CunWu, MA LiJuan, HE HongHong, WAN Peng, AN ZeShan, MAO Juan

(College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070）

【Objective】To explore the effects of different exogenous sugars on the growth and development of grape plantlets and the regulation of protein kinase gene transcription, the candidate genes were tapped in the process of protein phosphorylation by using transcription, which made a foundation for the verification of grape protein kinase-related gene function.【Method】Sucrose (2%), glucose (2%) and fructose (2%) were added to the basic medium, and the free-sugar treatment was as control, which were named as S20, G20, F20 and CK, respectively. After 37 days of culture, the fresh weight of the leaf-stem and root under different treatments was determined. Transcriptome sequencing of each treated foliages was performed by using Illumina HiSeqTM2000, and a series of protein kinases related genes were screened by integrated bioinformatics analysis, including reference genomic alignment, differentially expressed gene (DEGs) screening, COG (Cluster of Orthologous Groups of proteins) annotation, GO (Gene Ontology) annotation, etc., and the expression characteristic of these genes were further analyzed by qRT-PCR. 【Result】Compared with CK, ‘Red Globe’ grape plantlets under F20, G20 and S20 treatments exhibited significant differences in the fresh weight of leaf-stem, and the highest was obtained by F20 treatment, while the weight of fresh root under G20 was the highest. The SNP statistics found that the Transition was the main type of mutation, the second was Transversion. The highest number of SNPs that occurred in the Intergenic, and the next was the Upstream. Splice_Site_Donor and Synonymous_Stop events occurred with the least number of genes and equal. A total of 2 633 deferentially expressed genes were obtained in the 4 samples. The Venn diagram showed that there were a total of 180 differential genes under the 3 treatments compared with CK, and these genes were clustered into 3 groups. In the first group, 127 genes were only highly expressed under CK. The 19 genes of the second group were only highly expressed under G20, while the expression patterns of the 34 genes in third group were different under three treatments. The common 180 differential genes were annotated with 26 genes in the COG database to 11 functional categories, and these DEGs were mainly enriched in general functional categories. In the annotation of GO, the common genes were annotated in 14, 22 and 13 functional categories of molecular function, biological process and cellular component, respectively. Seven kinds of protein kinases were screened by this sequencing, including Glucokinase (GK), Mitogen-activated protein kinases (MAPKs), Calcineurin protein kinase (CBL), Protein phosphatase 2 (PP2A), Hexokinase (HXK), Histidine protein kinase (HPK) and Tyrosine kinase (TK), and these different protein kinases genes showed their own expression patterns among different treatments. By qRT-PCR analysis, 17 out of 20 screened genes expression were consistent with the transcriptome sequencing results. 【Conclusion】Compared with glucose and sucrose, fructose was the best sugar during grape culture process. The sequencing results showed that 180 DEGs all responded to three different sugars. In the COG annotation, these genes were mainly enriched in membrane ester transport and metabolism, the synthesis, transport and decomposition of secondary metabolites and carbohydrates. In the GO databases, the most of common DEGs were annotated in the activities of protein kinases and oxidoreductases. Seven protein kinases were identified, which were selectively in responses to different exogenous sugars in quantity, functional, category and metabolic pathways, and had their own choice of expression specificity.

RNA-seq; exogenous sugar; protein kinase; signaling transduction

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.001

2018-07-25；

2018-10-15

國家自然科學(xué)基金（31460500）、甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃（18ZD2NA006-4）、甘肅省現(xiàn)代水果產(chǎn)業(yè)體系崗位專家項(xiàng)目（GARS-SG-3）

梁國平，Tel：18298344227；E-mail：1143016341@qq.com。通信作者毛娟，E-mail：maojuan@gsau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）