Krüppel-like factor 3（KLF3）基因?qū)εＶ境练e的作用

郭紅芳，寧越，成功,2，昝林森,2

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Krüppel-like factor 3（KLF3）基因?qū)εＶ境练e的作用

郭紅芳1，寧越1，成功1,2，昝林森1,2

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2國(guó)家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

【目的】通過(guò)研究牛KLF3基因?qū)εＶ痉只椭舅岽x關(guān)鍵基因表達(dá)量的作用，進(jìn)而探討KLF3 基因?qū)χ|(zhì)沉積的影響?！痉椒ā亢铣筛蓴_siRNA，篩選得到KLF3基因干擾效率最高SiRNA，分離培養(yǎng)秦川牛肉用新品系新生牛前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-90%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染篩選得到的KLF3基因SiRNA和陰性對(duì)照SiRNA（NC），并進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)至第0天和第4 天時(shí)，利用熒光定量PCR方法研究分化標(biāo)志基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ,）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins α,），脂肪酸代謝關(guān)鍵基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase α,）和脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）基因在牛脂肪細(xì)胞分化不同時(shí)期干擾KLF3基因處理組和對(duì)照組之間表達(dá)量的變化，同時(shí)在干擾KLF3基因處理并進(jìn)行誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的第 4天采用油紅O染色法觀察干擾KLF3基因處理組和對(duì)照組之間脂滴差異及采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法測(cè)定甘油三酯含量進(jìn)一步確定KLF3基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化和脂肪酸代謝的作用?！窘Y(jié)果】 KLF3-Si2 具有最高的干擾效率達(dá)到73%。轉(zhuǎn)染KLF3-Si2后的表達(dá)量在牛脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第0天 和第4 天與對(duì)照組相比分別下調(diào)了58% 和37%，達(dá)到了差異極顯著（＜0.01），的表達(dá)量也分別下調(diào)了64% 和41%，達(dá)到了差異極顯著（＜0.01）。脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因FABP4的表達(dá)量與對(duì)照組相比在牛脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第0天和第4 天分別下調(diào)了89% 和60%，而的表達(dá)量干擾KLF3處理組與對(duì)照組相比在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第0天和第4天分別下調(diào)了50% 和37%, 而的表達(dá)量則分別下調(diào)了73% 和19%，都分別達(dá)到了差異極顯著（＜0.01）。在牛脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第4天油紅O染色和甘油三酯含量測(cè)定也發(fā)現(xiàn)干擾KLF3基因處理組與對(duì)照組相比脂滴減少，甘油三酯含量顯著下降（＜0.05）。【結(jié)論】干擾牛KLF3基因可以抑制牛脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量下調(diào)，進(jìn)而影響脂肪的沉積。

秦川牛；前脂肪細(xì)胞；；脂肪沉積

0 引言

【研究意義】動(dòng)物體內(nèi)肌內(nèi)脂肪沉積，影響肉的斷面大理石評(píng)分，可顯著提高牛肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味等感官品質(zhì)，最終影響肉質(zhì)等級(jí)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。因此，如何提高肌內(nèi)脂肪含量來(lái)滿足消費(fèi)者對(duì)牛肉嫩度和風(fēng)味的需要，一直是牛肉脂肪沉積生物分子調(diào)控研究的一個(gè)熱點(diǎn)[2]。脂肪沉積量主要取決于脂肪細(xì)胞增殖和分化程度，這一過(guò)程受諸多分化轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量及其活性大小決定了分化過(guò)程[3]。因此，深入研究牛脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于改善牛肉肉質(zhì)性狀具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】KLF家族是一類C端含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的重要的轉(zhuǎn)錄因子，能特異性結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮其調(diào)控功能，在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡方面起著重要的作用[4-7]。目前哺乳動(dòng)物中研究發(fā)現(xiàn)KLF家族成員有17個(gè)成員，大多數(shù)成員參與脂肪細(xì)胞形成。有研究表明、和在脂肪細(xì)胞分化中主要起抑制作用[7-9]，、、、、、和則主要起促進(jìn)作用[10-16]。KLF3基因是KLF家族中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，最早從紅細(xì)胞系中作為的同源系克隆得到[17]，最初體外研究發(fā)現(xiàn)其在3T3-L1脂肪細(xì)胞系中募集轉(zhuǎn)錄輔助阻遏物CtBP結(jié)合于的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮抑制作用[18-19]。但在體內(nèi)有大量研究表明KLF3基因敲除小鼠與同窩小鼠相比明顯瘦小、脂肪墊減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)主要是由于白色脂肪減少而造成的[19]。另外有研究發(fā)現(xiàn)干擾可增加動(dòng)物腸道脂肪沉積[20]，而且在雞脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雖然KLF3基因抑制脂肪細(xì)胞形成的一些關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子活性，但促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性[21]。另外有研究發(fā)現(xiàn)KLF3基因在調(diào)節(jié)脂質(zhì)聚集和分泌中起著重要作用。它可以通過(guò)促進(jìn)脂肪酸β-氧化調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，另外KLF3 基因突變可導(dǎo)致線蟲(chóng)中類似哺乳類的線粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白和載脂蛋白B的基因分別減少[22]。【本研究切入點(diǎn)】這些研究結(jié)果表明KLF3基因在脂肪沉積過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。目前還沒(méi)有關(guān)于KLF3基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的作用研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此，本研究以牛前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)干擾KLF3基因的表達(dá)，確定KLF3基因在牛脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝中的作用，為進(jìn)一步明確KLF3基因在調(diào)控牛脂肪沉積中的作用，改善牛肉品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究于2016年9月至2017年9月在西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和所需組織

秦川牛肉用新品系新生犢牛（3日齡）3頭的9個(gè)組織（心、肝、脾、肺、腎、大腸、瘤胃、腎周脂、肌肉）。

試驗(yàn)動(dòng)物和所需組織均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心良繁場(chǎng)，分別采集3頭牛的9個(gè)組織共計(jì)27個(gè)樣本后立即置于液氮罐中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牛前脂肪細(xì)胞獲取

選取臨床檢查無(wú)異常的秦川牛肉用新品系新生牛（3日齡），參照文獻(xiàn)[23]試驗(yàn)方法從新生牛腎周脂肪組織分離得到牛前脂肪細(xì)胞。將得到的牛前脂肪細(xì)胞沉淀加入適量的含10% FBS的完全培養(yǎng)基重懸、吹勻，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液1次，一般4—5 d長(zhǎng)滿，傳代于6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)傳代培養(yǎng)的牛前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至充分匯合時(shí)，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含10% FBS培養(yǎng)基+5 μg·mL-1胰島素+1 μg·mL-1地塞米松+0.5 mmol·L-13-異丁基-1甲基黃嘌呤）進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2 d后，再換成脂肪細(xì)胞分化維持培養(yǎng)基（10% FBS+1 μg·mL-1胰島素）進(jìn)行培養(yǎng)2 d。

1.3 SiRNA轉(zhuǎn)染

牛KLF3基因的干擾RNA（SiKLF3）和對(duì)照SiRNA（NC）由上海吉瑪公司合成，序列如表1所示。當(dāng)牛前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至70%—90%匯合時(shí)，先用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞2 h，然后分別將5 μL干擾SiRNA 和對(duì)照組SiRNA溶解于125 μL OPTI培養(yǎng)基中，另外將3.75 μL lipofectin3000加入125 μL OPTI后和稀釋的SiRNA混勻靜置5 min后逐滴加入6孔板中。轉(zhuǎn)染6 h后換成含有10% FBS的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染2 d后細(xì)胞生長(zhǎng)至充分匯合時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)至第4天。

1.4 RNA提取和qRT-PCR

按照TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū)分別提取新生牛9種組織RNA和誘導(dǎo)分化第0天和第4天的秦川牛脂肪細(xì)胞的總RNA并分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供牛、、、、和基因 mRNA 序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)基因表達(dá)分析引物，以牛GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參（NM_001034034）采用qRT-PCR方法檢測(cè)各組織和基因的表達(dá)，引物見(jiàn)表1。20μL反應(yīng)體系：2×SYBR Premix EX TaqⅡ 10 μL, 上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL, 稀釋至50 ng·μL-1的cDNA 2 μL，RNase-freedd-H2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 30 s 預(yù)變性后 95℃ 5 s, 60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用2-ΔΔCt法計(jì)算各組織和細(xì)胞中基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 油紅O染色和甘油三酯含量測(cè)定

將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)至第4天的脂肪細(xì)胞用PBS洗2—3次后用4%多聚甲醛固定培養(yǎng)板貼壁細(xì)胞30 min后, PBS漂洗。吸取油紅O 染液1 mL 浸染培養(yǎng)板, 30 min 后倒掉油紅O 染液, PBS漂洗培養(yǎng)板2—3次, 至完全漂洗干凈。置于倒置相差顯微鏡下觀察, 并照相, 采集油紅O染色圖片。

表1 試驗(yàn)中所用引物

甘油三酯含量利用牛甘油三酯測(cè)定ELISA試劑盒按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，經(jīng)過(guò)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備，分別加樣于96孔板，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次后加入酶標(biāo)試劑，37℃ 30 min，顯色10 min后加入終止液，在490 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值并計(jì)算。分別測(cè)定誘導(dǎo)分化第4 天，干擾和對(duì)照組兩組之間甘油三酯的含量。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6 Western blot

將轉(zhuǎn)染Si-KLF3后2 d的牛前脂肪細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，室溫下用PBS洗細(xì)胞3次，然后向6孔板中加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)至1.5 mL 離心管中12 000 r/min 4℃離心10 min后，將上清（細(xì)胞總裂解物）轉(zhuǎn)至新的離心管，與蛋白上樣buffer混合，在100℃煮沸10 min使蛋白質(zhì)變性。每個(gè)樣品取10—20 μL進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，采用BIO-RAD的MiNi Trans-Blot將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于封閉液（5%脫脂奶粉的PBST），室溫封閉2 h，或4℃過(guò)夜。洗去膜上的封閉液，將膜孵育在含羊抗兔的KLF3多克隆抗體（ab154531，Abcam，Cambridge，UK）或GAPDH兔單克隆抗體（ab181603，Abcam，Cambridge，UK）的PBST溶液，置于搖床上，室溫反應(yīng)2 h或4℃過(guò)夜；洗膜后將膜孵育在含羊抗兔IGg二抗（ab6721，Abcam，Cambridge，UK）的PBST溶液；再次洗膜后常規(guī)ECL顯色。

1.7 KLF3基因生物學(xué)特征分析

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastp（http://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因的同源性；應(yīng)用MEAG7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Student-T和ANVOA 方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”以＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 牛KLF3基因的生物學(xué)表達(dá)特征

將牛KLF3 基因蛋白序列和GenBank公布的其他物種的序列進(jìn)行Blastp比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF3 的蛋白序列不但與反芻動(dòng)物具有較高的同源性高達(dá)98%，而且與人和家鼠也具有很高的同源性，比對(duì)見(jiàn)表2。另外，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)后發(fā)現(xiàn)KLF3基因與反芻動(dòng)物親緣關(guān)系較近，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 牛KLF3基因蛋白Blastp比對(duì)

圖1 牛KLF3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 牛KLF3基因組織和脂肪細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律分析

qRT-PCR 結(jié)果表明KLF3 基因在新生牛的肝臟、瘤胃和脂肪中有比較高的表達(dá)量與其他組織表達(dá)量相比達(dá)到了差異顯著（＜0.05）（圖2-A），而在肌肉中表達(dá)量最低。而KLF3 基因在牛前脂肪細(xì)胞分化中的規(guī)律發(fā)現(xiàn)，KLF3 基因隨著脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程推進(jìn)，其表達(dá)量逐漸增加（圖2-B）。這表明KLF3 基因在脂肪組織形成和脂肪細(xì)胞分化中也許有比較重要的作用。

2.3 干擾KLF3基因?qū)εＧ爸炯?xì)胞分化和脂肪酸代謝的影響

為進(jìn)一步研究KLF3 基因在牛脂肪細(xì)胞分化中的作用，我們合成SiRNA干擾KLF3 基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染牛前脂肪細(xì)胞。在干擾KLF3 基因2 d 后分別提取牛 KLF3 基因干擾處理組和對(duì)照組（NC）RNA檢測(cè)其干擾效率。我們發(fā)現(xiàn)Si2與對(duì)照組相比具有最高的干擾效率達(dá)到了73%。另外蛋白水平也發(fā)現(xiàn)干擾KLF3 基因處理組其蛋白水平也明顯下調(diào)（圖3）。并且在牛前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中用Si2干擾KLF3 基因后發(fā)現(xiàn)，在脂肪細(xì)胞分化的第0 和第4 天 KLF3 基因的表達(dá)量分別下調(diào)了73% 和 54%與對(duì)照組相比達(dá)到了極顯著差異（＜0.01，圖4）。因此，后續(xù)試驗(yàn)中轉(zhuǎn)染Si2用于干擾KLF3 基因的表達(dá)，并檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因和以及脂質(zhì)代謝基因、和的表達(dá)量變化。

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Si2干擾 KLF3 基因表達(dá)后的表達(dá)量在牛脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第0和第4 天與對(duì)照組相比分別下調(diào)了58%和37%，達(dá)到了差異極顯著（＜0.01），的表達(dá)量也分別下調(diào)了64% 和41%，達(dá)到了差異極顯著（＜0.01，圖5）。同樣干擾KLF3 基因檢測(cè)對(duì)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第0天和第4天分別下調(diào)了89%和60%，而的表達(dá)量干擾處理組和對(duì)照組相比在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第0和第4天分別下調(diào)了50%和37%, 而的表達(dá)量則分別下調(diào)了73% 和19%，都達(dá)到了差異極顯著（＜0.01，圖6）。

圖2 KLF3基因在秦川牛新生牛中組織表達(dá)譜分析（A）和牛脂肪細(xì)胞中時(shí)序表達(dá)譜分析（B）

A：干擾si2- KLF3 后蛋白表達(dá)量；B：不同Si處理后KLF3的相對(duì)表達(dá)量

** 表示差異極顯著，P＜0.01。下同

2.4 油紅O染色和細(xì)胞脂肪含量的測(cè)定

為進(jìn)一步從表型上確定KLF3基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化的影響，干擾牛KLF3基因處理后并誘導(dǎo)分化至第4天，從形態(tài)學(xué)上用油紅O染色法測(cè)定干擾KLF3 基因處理組和對(duì)照組脂滴的差異。另外用牛甘油三酯測(cè)定試劑盒測(cè)定干擾處理組和對(duì)照組中甘油三酯的含量。結(jié)果表明干擾KLF3 基因抑制牛脂肪細(xì)胞分化，與對(duì)照組相比干擾處理組的脂滴較少，干擾和對(duì)照組相比甘油三酯含量明顯減少并達(dá)到顯著差異（＜0.05，圖7，圖8）。

圖5 牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中干擾牛 KLF3 基因PPARγ和C/EBP α的相對(duì)表達(dá)量

圖6 牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中干擾牛KLF3 基因ACCα、FAS和FABP4 的相對(duì)表達(dá)量

圖7 干擾KLF3基因并誘導(dǎo)牛脂肪細(xì)胞分化至第4天油紅O染色圖

* P＜0.05

3 討論

牛肉品質(zhì)主要受脂肪沉積的影響，而脂肪沉積主要與脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝密切相關(guān)[1,24]。大量研究表明KLF家族在脂肪細(xì)胞分化中具有重要作用，并且其家族成員大多數(shù)位于上游網(wǎng)絡(luò)調(diào)控脂肪細(xì)胞分化。KLF3 基因是KLF家族重要一員，大量研究表明其在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝中具有重要作用[17,22]。本研究通過(guò)不同物種蛋白比對(duì)和基因進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建發(fā)現(xiàn) KLF3 基因蛋白序列不但與反芻動(dòng)物具有較高同源性，高達(dá)98% 以上，而且其與人和家鼠蛋白序列同源性也高達(dá)94% 以上，這說(shuō)明 KLF3 基因在不同物種中都具有重要作用，而且系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF3 基因與水牛和綿羊這類反芻動(dòng)物具有更近的親緣關(guān)系，這也側(cè)面反映了KLF3 基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守。另外研究發(fā)現(xiàn)KLF3 基因在新生牛中具有廣泛表達(dá)特性并且在脂肪組織中相對(duì)表達(dá)水平較高這與在其他物種上的研究一致[19,21]。KFL3 基因的廣泛表達(dá)性也表明其在機(jī)體生命活動(dòng)中有著不可或缺的作用，而且其在脂肪組織中有較高表達(dá)量，并且隨著脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程中其表達(dá)量逐漸增加也說(shuō)明KLF3 基因也許在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積中起著重要作用，這也與前人關(guān)于KLF3基因在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用研究相一致[9,21-22]。因此，深入研究 KLF3 基因在牛脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積作用對(duì)改善肉牛肉質(zhì)性狀具有重要的意義。

和作為脂肪細(xì)胞分化的中后期標(biāo)志基因，在脂肪細(xì)胞分化中具有關(guān)鍵的作用，其表達(dá)量的變化影響著脂肪細(xì)胞的成熟[25-26]。目前關(guān)于KLF3 基因在脂肪細(xì)胞分化中的作用還不明確，ZHANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)在雞脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá) KLF3 基因可促進(jìn)PPARγ 基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，而在3T3-L1細(xì)胞中有研究發(fā)現(xiàn)KLF3基因通過(guò)抑制基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性從而抑制脂肪細(xì)胞分化[19]。本研究通過(guò)篩選最佳干擾牛KLF3 基因的SiRNA，轉(zhuǎn)染至牛前體脂肪細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因和表達(dá)量都隨著KLF3 基因表達(dá)量下調(diào)明顯下降（＜0.01）。這表明KLF3基因在牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中抑制脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因和表達(dá)從而抑制牛前脂肪細(xì)胞分化。不同物種中 KLF3 基因?qū)χ炯?xì)胞分化關(guān)鍵基因調(diào)控的差異也許是由于物種的差異性，因此，后續(xù)還需進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制方面進(jìn)行更深入的研究。

脂肪細(xì)胞的功能主要是合成并儲(chǔ)存甘油三酯，而甘油三酯的合成在基因水平主要涉及脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成。是脂肪酸結(jié)合蛋白，主要負(fù)責(zé)長(zhǎng)鏈脂肪酸的攝取，轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝調(diào)節(jié)，在脂肪酸合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用[27-28]。即脂肪酸合成酶，是脂肪酸從頭合成過(guò)程中的催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A聚合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的主要限速酶，該酶的活性及數(shù)量對(duì)動(dòng)物體脂的沉積有重要影響，其表達(dá)量升高能顯著增加甘油三酯的沉積[29-30]。而與一樣也是動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸合成的限速酶，它催化合成的丙二酰COA是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的前體物質(zhì)[31]。有研究發(fā)現(xiàn)KLF3 基因通過(guò)調(diào)控β-氧化調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，另外，突變KLF3基因可使脂肪酸代謝關(guān)鍵基因下調(diào)[20,22]，這說(shuō)明KLF3基因在脂肪酸代謝中也具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)干擾牛KLF3基因轉(zhuǎn)染牛脂肪細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝基因、及的表達(dá)量也明顯下調(diào)（＜0.01），干擾KLF3 基因抑制脂肪酸代謝關(guān)鍵基因的下調(diào)，說(shuō)明KLF3 基因在牛脂肪細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)參與脂肪酸代謝從而調(diào)控甘油三酯的積累。

隨后通過(guò)干擾牛KLF3 基因后，進(jìn)行油紅O染色并測(cè)定甘油三酯含量，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，干擾?；蚪M脂滴減少，甘油三酯含量下調(diào)，并且達(dá)到了差異顯著（＜0.05）。這進(jìn)一步說(shuō)明干擾KLF3 基因能夠抑制牛脂肪形成并且綜合脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因和脂肪酸代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量的下調(diào)，說(shuō)明干擾牛KLF3 基因抑制牛脂肪細(xì)胞分化，抑制脂滴積累。這與敲除小鼠脂肪減少結(jié)果一致[19]。總之，在牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，干擾 KLF3 基因抑制脂滴形成和甘油三酯積累。

4 結(jié)論

牛KLF3 基因通過(guò)抑制牛脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因和及脂肪酸代謝關(guān)鍵基因、及的表達(dá)抑制牛脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸代謝，從而影響甘油三酯的積累和脂質(zhì)沉積。為進(jìn)一步研究牛KLF3基因調(diào)控脂質(zhì)沉積、脂肪酸代謝和改善牛肉品質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了依據(jù)。

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The Effect of Krüppel-like Factor 3 (KLF3) Gene on Bovine Fat Deposition

GUO HongFang1, NING Yue1, CHENG Gong1,2, ZAN LinSen1,2

(1College of Animal Science and Technology, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi;2National Beef Cattle Improvement Center, Yangling, 712100, Shaanxi)

【Objective】This study aimed to investigate the effects of bovine Krüppel-like factor 3 (KLF3) gene on bovine adipocytes differentiation and fatty acid metabolism, and to explore the effect of KLF3 gene on lipid deposition. 【Method】This research synthesized interference RNA (siRNA) of, and then transfected KLF3 gene SiRNA and negative to the Qinchuan cattle preadipocytes when the cells grew to a confluence of 70%-90%. The QPCR method was used to determine the expression of adipocyte differentiation marker genesandas well the key genes,andgene interfered. At the same time, on the 4th day of inducing adipocyte differentiation after interfering with KLF3 gene treatment, oil red O staining was used to observe the difference of lipid droplets between the KLF3 gene treatment group and the control group, and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to determine the triglyceride content to further determine the effect of the KLF3 gene on bovine adipocyte differentiation and lipid metabolism. 【Result】The results indicated that KLF3-Si2 had the highest interference efficiency, which was 73%. After transfected with KLF3-Si2, on the 0th and 4th day of bovine adipocytes induced differentiation, the expression ofwas extremely significant (＜0.01) down-regulated by 58% and 37%, respectively; the expression ofwas also extremely significant (＜0.01) down-regulated by 64% and 41%, respectively; the expression level of, a key gene for lipid metabolism, was down-regulated by 89% and 60%, respectively; while the expression ofinterfered with thetreatment group and the control group was down-regulated by 50% and 37%, respectively; the expression ofwas down-regulated by 73% and 19%, respectively, and all the difference was extremely significant (＜0.01). On the 4th day of induced differentiation, oil red O staining and triglyceride content determination also showed that the lipid droplets were decreased and the triglyceride content was significantly decreased in the silence KLF3 gene treated group compared with the control group (＜0.05). 【Conclusion】Interfering with bovine KLF3 gene could inhibit bovine adipocytes differentiation and fatty acid synthesis key genes expression, thus affecting fat deposition.

Qinchuan cattle; preadipocytes;; fat deposition

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.014

2018-10-10；

2019-01-22

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（No.2018YFD0501700）、國(guó)家863計(jì)劃（No.2013AA102505）、國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37）

郭紅芳，E-mail：guohongfangkl@126.com。通信作者昝林森，E-mail：zanlinsen@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）