辣木葉提取物的抗氧化活性研究

趙一鶴，李 沁，夏 菁，施 蕊，陳 薇，鄒 潔，張靜美

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明 650021；2.西南林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，云南昆明 650024；3.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650021)

辣木(Moringaoleifera)又稱為鼓槌樹(drumstick tree)，因其具有辛辣味的根而得名[1-2]，是辣木亞目(Moringineae)辣木科(Moringaceae)辣木屬(MoringaAdans.)植物的統(tǒng)稱[3-4]，原產(chǎn)于熱帶及南亞熱帶的干旱或半干旱區(qū)域，在我國未見自然分布，目前我國已將其作為經(jīng)濟型植物引進(jìn)種植。

自由基是一類具有不成對電子的原子和基團(tuán)，是機體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有強的氧化性，可損害機體組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性毒性和細(xì)胞衰亡作用，存在于植物和動物細(xì)胞中，是生命體細(xì)胞凋亡的一個重要誘因。體內(nèi)活性氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基等，本身具有一定的功能，但過多的活性氧自由基就會有破壞行為，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織損壞，從而引起多種疾病，如心臟病、老年癡呆癥、帕金森病和腫瘤。外界誘因會使人體產(chǎn)生更多活性氧自由基，使核酸突變，這是人類衰老和患病的根源。因此，抗氧化作用成為人們維護(hù)健康所關(guān)注的熱點，各類抗氧化劑和抗氧化保健日化品成為熱銷產(chǎn)品。

Sholapur等[5]研究結(jié)果表明，辣木能夠抑制周緣組織內(nèi)由地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抗性。Jaiswal等[6]通過體外和體內(nèi)試驗證實辣木葉片具有顯著的抗氧化活性，能保護(hù)正常人及糖尿病患者免受氧化脅迫的損傷。辣木籽油因含辣木多糖，具有一定的抗氧化活性，辣木葉抗氧化活性的研究鮮見報道。國內(nèi)引進(jìn)時間較短，目前對辣木的研究主要集中在引種栽培[7-8]、營養(yǎng)成分[9-10]以及辣木油的提取工藝[11-12]等方面，關(guān)于辣木生物活性的研究較少[13-14]。筆者對辣木葉乙醇初提物用不同極性的溶劑進(jìn)行萃取，得到辣木葉石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物，采用DPPH(二苯代苦味酰基)和鄰苯三酚自氧化法對辣木葉的抗氧化活性進(jìn)行測定。通過不同的抗氧化活性測定，明確辣木葉中具有抗氧化活性的萃取物部分，以期為辣木葉中具有抗氧化活性的化合物的進(jìn)一步分離奠定基礎(chǔ)，也為辣木葉開發(fā)成天然抗氧化劑或天然日化產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1辣木葉辣木鮮葉樣品采自云南省大理州賓川縣，將其陰干，備用。

1.2儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、UV-紫外分光光度計、循環(huán)水式多用真空泵、電爐、電子天平、移液管、移液槍、膠頭滴管、試管、培養(yǎng)皿、鑷子。

1.3試劑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、蒸餾水、DPPH、無水乙醇、抗壞血酸。

1.4原材料處理將辣木葉用75%的乙醇冷浸3次，合并3次濾液，于55 ℃下旋蒸濃縮，再依次用等體積石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯對所得浸膏進(jìn)行萃取，要求每種試劑都萃取3次，以達(dá)到萃取層基本無雜色。合并每種溶劑所得萃取液，減壓濃縮至干。萃取結(jié)束后，得到3層濃縮浸膏，即石油醚層浸膏、二氯甲烷層浸膏及乙酸乙酯層浸膏。

1.5抗氧化活性測定

1.5.1溶液的配制。

1.5.1.1DPPH抗氧化法。精密稱取辣木各提取層0.1 g，用95%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶，搖勻，超聲20 min，作為母液。精密稱取2 mg DPPH，加無水乙醇40 mL，超聲5 min。用分光光度計在517 nm處測得吸光度，由此來計算抗氧化能力。

1.5.1.2鄰苯三酚自氧化法。樣品溶液：精密稱取0.300 g樣品，加10 mL緩沖液，備用。0.1 mol/L Tris：精密稱取1.21 g Tris，0.037 2 g EDTA，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中；0.1 mol/L HCl：0.85 mL 36%HCl溶液，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中；pH 8.2 Tris-HCl緩沖液：50 mL 0.1 mol/L Tris，22.9 mL 0.1 mol/L HCl蒸餾水定容于100 mL蒸餾水；10 mmol/L鄰苯三酚：精密稱取0.630 6 g鄰苯三酚定容于100 mL容量瓶中。

1.5.2DPPH抗氧化法測定。按表1分別取2 mL不同濃度(100、200、300、400、500 μg/mL)樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻。室溫放置30 min后于517 nm處測吸光值，用抗壞血酸(VC)作為陽性對照。

表1 DPPH法試劑加入量

計算樣品對DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率= [1-(A1-A3)/A2]×100%

式中，A1為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值；A2為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光值；A3為2 mL樣品溶液+2 mL 無水乙醇的吸光值。

1.5.3鄰苯三酚自氧化法測定。取50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL，置于25 ℃水浴中保溫20 min，按表2依次加入不同濃度(200、400、600、800、1 000 μg/mL)樣品溶液、鄰苯三酚溶液和蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，每30 s在325 nm處測定吸光值。

表2 鄰苯三酚法試劑加入量

計算樣品對超氧陰離子自由基(O2·-)的抑制率：

鄰苯三酚自氧化率=(第4分鐘的OD325-第1分鐘的OD325)/3

抑制率=(鄰苯三酚自氧化率-加樣后鄰苯三酚自氧化率)/鄰苯三酚自氧化率× 100%

2 結(jié)果與分析

2.1辣木葉提取物對DPPH自由基的清除作用從圖1可以看出，辣木葉石油醚層具有抗氧化活性，并且隨著樣品濃度的增大，辣木葉石油醚層對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，在樣品濃度為500 μg/mL時趨于平緩，清除率達(dá)86.07%；辣木葉二氯甲烷層對DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增大逐漸增強，在濃度為300 μg/mL時趨于平緩，清除率達(dá)89.32%；辣木葉乙酸乙酯層對DPPH自由基的清除能力逐漸增強。在濃度為200 μg/mL時趨于平緩，清除率達(dá)92.06%。

辣木提取物的石油醚層、二氯甲烷層和乙酸乙酯層都對DPPH自由基具有一定的清除作用。同時，乙酸乙酯層清除DPPH自由基的能力強于二氯甲烷層，而二氯甲烷層的清除能力強于石油醚層。并且在相同濃度梯度下，辣木葉各個提取層清除DPPH自由基的能力低于陽性對照組VC。

圖1 辣木葉提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of the extract from the leaves of Moringa oleifera on DPPH radical

2.2辣木葉提取物對超氧陰離子自由基的清除作用由圖2可知，辣木葉石油醚層提取物對超氧陰離子自由基的清除率較低，在樣品濃度達(dá)1 000 μg/mL時為19.31%，而二氯甲烷層提取物在樣品濃度為800 μg/mL時清除率為24.81%，相對乙酸乙酯層對超氧陰離子自由基的清除率較低。相同條件下，乙酸乙酯層提取物在濃度為400 μg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除率達(dá)36.10%，和其他提取物相比，其抗氧化作用較強，雖然和陽性對照物VC相比，對超氧陰離子自由基的抑制率還是較低，但該試驗采用的材料是辣木葉提取物而不是單體，而VC為單體化合物，因此下一步將考慮把辣木葉乙酸乙酯層進(jìn)行分離純化，獲得活性單體化合物再進(jìn)行抗氧化活性研究。

辣木葉提取物的石油醚層、二氯甲烷層和乙酸乙酯層都對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用。同時，乙酸乙酯層對超氧陰離子自由基的抑制能力強于二氯甲烷層，而二氯甲烷層的抑制能力強于石油醚層。在相同濃度梯度下，辣木葉各個提取層對超氧陰離子自由基的抑制能力均低于陽性對照組VC。

圖2 辣木葉提取物對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of the extract from the leaves of Moringa oleifera on superoxide anion radical

3 結(jié)論與討論

該研究對辣木葉乙醇初提物用不同極性的溶劑進(jìn)行萃取[15-16]，得到辣木葉石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物，并同時進(jìn)行抗氧化活性試驗。植物抗氧化測定方法主要集中在脂質(zhì)體過氧化、自由基清除率和抗過氧化物歧化酶等方面，其中DPPH法是最常用的抗氧化測定方法，DPPH法是基于DPPH有機溶劑在520 nm處有最大吸收波長，如抗氧化劑同時存在時與其孤對電子配對而吸收減弱的原理檢測抗氧化劑對自由基的清除效率，是評價抗氧化劑最常用的方法。鄰苯三酚法則屬于抗過氧化物歧化酶活性測定范圍，利用鄰苯三酚在自氧化過程中產(chǎn)生有色中間體和超氧陰離子，利用SOD分解而間接推算酶活力的方法。該研究通過比較不同的抗氧化活性，明確辣木葉中的抗氧化活性部位，通過2種抗氧化方法的比較，確定辣木葉提取物中乙酸乙酯提取物的抗氧化作用主要為對自由基的清除作用，為下一步開發(fā)辣木葉天然抗氧劑提供了理論基礎(chǔ)[16]。

在抗氧化試驗中，測定辣木葉石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯3個提取層的DPPH自由基清除作用，3個提取層均有清除作用，且隨濃度的增大而增大，同時在相等的濃度條件下，乙酸乙酯層抗氧化效果最強，其次是二氯甲烷層，再次是石油醚層。植物的抗氧化能力多與其多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的含量有一定的關(guān)系，乙酸乙酯層比其他2層抗氧化效果好可能是由于其主要萃取植物中黃酮和多酚成分。雖然各提取層清除DPPH自由基的能力均低于VC，但是在濃度為500 μg/mL以上時，各層對DPPH自由基清除率都為90%左右。

由此可見，辣木葉具有良好的抗氧化性，具有潛在的開發(fā)價值?？寡趸瘎┦鞘称?、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域常用和必須使用的輔料和添加劑?；瘜W(xué)合成抗氧化劑對身體有一定的毒性和致突變作用，隨著消費者對天然健康的需求日益加強，天然抗氧化劑將是未來抗氧化劑研究和開發(fā)的重點。辣木葉是一種極具開發(fā)潛力的天然抗氧化劑，其在2012年被列入國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的新資源食品目錄，使得辣木葉的綜合開發(fā)利用成為可能，作為食品級原料，其安全性已經(jīng)得到認(rèn)可，如能在此基礎(chǔ)上對其功能性進(jìn)行開發(fā)利用，將擴大辣木葉的價值和利用范圍。辣木葉作為一種新型抗氧化劑或抗衰老保健品，也可以對其單體化合物的抗氧化功能做進(jìn)一步研究，以期開發(fā)出相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品。