原花青素對(duì)Aβ25-35介導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化及p38 M APK信號(hào)通路的影響

王 旭，張小強(qiáng)，*，劉 靜，陳姚姚，盧曉星，苗歆雨

(1．東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京

210009；2．東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD的主要病理特征包括老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，過度磷酸化的tau蛋白與微管蛋白的結(jié)合能力降低，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)相互聚集成雙螺旋樣纖維(PHFs)，導(dǎo)致NFTs的形成[2]。雖然由β淀粉樣前體蛋白水解而來的β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)毒性曾被認(rèn)為在AD發(fā)展中起主要作用，但近來越來越多的證據(jù)卻表明過度磷酸化的tau蛋白在AD等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。氧化應(yīng)激是AD的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，Aβ的產(chǎn)生和聚集與其關(guān)系緊密。Aβ通過多條途徑誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，并可作用于多靶點(diǎn)加劇氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致線粒體損失，進(jìn)一步引起tau蛋白的高度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變，最終造成AD的發(fā)病[4-5]。而由于磷酸酯酶和蛋白激酶活性的失調(diào)，使正常的tau蛋白喪失與微管結(jié)合能力造成微管不穩(wěn)定，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙，神經(jīng)變性至最終的功能缺陷[6]。其中絲裂原活化蛋白激酶(miotgenactivated protein kinase，MAPK)是tau蛋白過度磷酸化的關(guān)鍵性激酶，其中p38 MAPK (p38 miotgenactiveted protein kinase)是其中的重要組成部分。研究顯示激活p38 MAPK可引起神經(jīng)系統(tǒng)tau蛋白的過度磷酸化[7]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是一種生物學(xué)功能廣泛的多酚類化合物，具有極強(qiáng)的抗氧化活性。目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)PC可有效改善AD大鼠海馬組織中由Aβ沉積所導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者在PC對(duì)tau蛋白過度磷酸化的作用及其作用機(jī)制方面的關(guān)注相對(duì)較少[8-9]。本實(shí)驗(yàn)利用β-淀粉樣蛋白25-35片段(Aβ25-35)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建模型，使用原花青素進(jìn)行干預(yù)并探討其對(duì)tau蛋白過度磷酸化及p38 MAPK信號(hào)通路的影響，以期更好地明確其生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

原花青素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Aβ25-35、四甲基噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide， MTT)、 二 甲 基 亞 砜 (dimethylsulphoxide，DMSO)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)買于Thermo Fisher公司；胎牛血清購(gòu)于Clark Bio公司；人成神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；Bradford蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；微量丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tau、p-Tau(Ser396)、p38、p-p38、SB203580阻斷劑及actin一抗和二抗、Western blot化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 主要儀器

Series 8000恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)于Thermo Scientific公司；IX51倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；5417R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf AG公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀購(gòu)自Rayto公司；Sonicator 4000超聲破碎儀，購(gòu)于Misonix Inc公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人成神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHSY5Y培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素與100 mg/mL鏈霉素)，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每2 d換液1次，每周傳代1次。

1.3.2 藥物配制 將20 mg原花青素溶于20 mL培養(yǎng)液中，制成終濃度為1 mg/mL的母液，分裝后置于-20℃保存。將冷凍干燥的1 mg Aβ25-35溶于965μL純水，制成1 mmol/L的母液，分裝，37℃恒溫箱孵育7 d，形成凝聚態(tài)后于-20℃保存；臨用前，將藥物稀釋至所需濃度。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在檢測(cè)原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響時(shí)，分為調(diào)零組、對(duì)照組、不同濃度(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)原花青素干預(yù)組；在檢測(cè)Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響時(shí)，分為調(diào)零組、Aβ25-35對(duì)照組、不同濃度(0.1、1.0、2.5、10.0、20.0μmol/L)Aβ25-35染毒組；在檢測(cè)原花青素干預(yù)對(duì)Aβ25-35染毒的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響時(shí)，分為調(diào)零組、對(duì)照組、1.0μmol/L Aβ25-35染毒組、不同濃度(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)原花青素+1.0μmol/L Aβ25-35處理組。調(diào)零組不含細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，處理組加入原花青素或和Aβ25-35后稀釋至指定濃度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液10μL，37℃孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(496)值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率/%=[D(496)實(shí)驗(yàn)組-D(496)調(diào)零組]/[D(496)對(duì)照組-D(496)調(diào)零組]×100%

1.3.4 硫代巴比妥法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量 將SHSY5Y細(xì)胞以6×105個(gè)/mL的濃度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿1 mL，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)對(duì)照組，1.0 μmol/L Aβ25-35染毒組，不同濃度(0.1、1.0、2.5和5.0 μg/mL)原花青素+1.0μmol/L Aβ25-35干預(yù)組。繼續(xù)孵育24 h后，以預(yù)冷PBS收集細(xì)胞，至冰水混合物中，超聲波勻漿共30 s細(xì)胞破碎，按試劑盒說明書檢測(cè)并計(jì)算各組樣本中MDA濃度。

MDA 濃度/(nmol/mg)=[D(532)測(cè)定值-D(532)對(duì)照值]/[D(532)標(biāo)準(zhǔn)值-D(532)空白值]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/待測(cè)樣本蛋白濃度

1.3.5 WST-8法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總SOD活力 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及提取同1.3.4，分別在待測(cè)樣品和空白對(duì)照組中加入相應(yīng)的WST工作液和酶工作液，于37℃中孵育20 min，并計(jì)算各組樣本的SOD抑制率及SOD活力。

1.3.6 Western blot檢測(cè)p-tau、tau、p38、p-p38蛋白表達(dá)水平 SH-SY5Y細(xì)胞以6×105個(gè)/mL的濃度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，分組同1.3.4。收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白，高速離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白濃度試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。將蛋白進(jìn)行凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、p-tau、tau、p38、p-p38一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗m-IgGκBP-HRP和山羊抗兔IgG-HRP孵育2 h，再次洗膜，最后加Western blot化學(xué)發(fā)光劑顯影，并用Image J軟件對(duì)灰度值結(jié)果進(jìn)行分析。使用同樣的方法分別檢測(cè)對(duì)照組、Aβ25-35染毒組、SB203580組、Aβ25-35+SB203580組、Aβ25-35+5.0 μg/mL原花青素干預(yù)組的p-tau、tau、p38、p-p38的蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±s表示，應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，不齊時(shí)采用Dunnett-T3檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。線性相關(guān)分析結(jié)果用相關(guān)系數(shù)r表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的原花青素對(duì)細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，與對(duì)照組相比，0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL原花青素單獨(dú)作用下，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。該結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所用劑量范圍內(nèi)，原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞無明顯毒性作用。

圖1 原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2.2 不同濃度Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。與對(duì)照組相比，不同濃度Aβ25-35均使SH-SY5Y細(xì)胞活力降低(P＜0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1.0μmol/L Aβ25-35染毒細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型。

圖2 不同濃度Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2.3 原花青素干預(yù)對(duì)Aβ25-35染毒SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。與染毒組(1.0μmol/L Aβ25-35)相比，原花青素干預(yù)24 h后，細(xì)胞存活率呈不同程度升高，其中0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL原花青素干預(yù)組與Aβ25-35組及對(duì)照組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。

圖3 原花青素對(duì)Aβ25-35染毒細(xì)胞存活率的影響

2.4 原花青素對(duì)Aβ25-35染毒SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

原花青素對(duì)Aβ25-35染毒細(xì)胞MDA和SOD水平的影響如表1所示，可見，與對(duì)照組相比，1.0μmol/L的Aβ25-35使細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增高，而細(xì)胞SOD活力明顯降低。隨著原花青素濃度的升高，MDA水平呈現(xiàn)不同程度的下降，而SOD水平則呈不同程度升高。其中，1.0、2.5、5.0μg/mL的原花青素促進(jìn)細(xì)胞SOD活力增強(qiáng)(P＜0.05)，5.0μg/mL的原花青素使細(xì)胞MDA生成減少(P＜0.01)，而5.0μg/mL的原花青素可逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導(dǎo)改變的MDA水平，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1不同濃度原花青素對(duì)Aβ25-35染毒細(xì)胞中MDA濃度和SOD活力的影響

2.5 原花青素對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組比較，給予Aβ25-35(1.0μmol/L)刺激，SH-SY5Y細(xì)胞ptau蛋白表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與1.0 μmol/L Aβ25-35組相比，原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞，p-tau(Ser396)蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，且磷酸化水平呈劑量依賴性降低(r=0.755，P＜0.05)。

圖4 原花青素對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響

2.6 原花青素對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞p38蛋白磷酸化的影響

Western blot法檢測(cè)原花青素對(duì)Aβ25-35染毒細(xì)胞p38 MAPK通路的影響結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組比較，給予Aβ25-35(1.0μmol/L)刺激，SH-SY5Y細(xì)胞pp38蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)。與1.0 μmol/L Aβ25-35組相比，原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞，p-p38蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，且磷酸化水平呈劑量依賴性降低(r=0.768，P＜0.05)。

2.7 原花青素通過p38 MAPK通路抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化

應(yīng)用SB203580阻斷劑對(duì)p38、tau蛋白及其磷酸化水平影響的結(jié)果如圖6所示。與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用阻斷劑組并未改變p-p38、p-tau(Ser396)蛋白表達(dá)水平(P＞0.05)。Aβ25-35誘導(dǎo)組可顯著上調(diào) p-p38、p-tau(Ser396)蛋白表達(dá)(P＜0.05)。與 Aβ25-35染毒組比較，Aβ25-35+SB203580組的p-p38、p-tau(Ser396)蛋白水平明顯下調(diào)，Aβ25-35+5.0μg/mL原花青素干預(yù)組的p-p38、p-tau(Ser396)水平也明顯下降(P＜0.05)。

圖5 原花青素對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞p38蛋白磷酸化的影響

圖6 p38在原花青素抑制Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的作用

3 討論

Tau蛋白是一種可溶性微管相關(guān)蛋白，在促進(jìn)微管組裝和維護(hù)微管穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用，在神經(jīng)元中表達(dá)，其主要定位于軸突。微管蛋白裝配成微管后，tau蛋白與原纖維絲保持垂直的狀態(tài)結(jié)合，減少微管的彈性，增加微管的穩(wěn)定性[10]。然而，在AD患者中觀察到tau蛋白磷酸化水平的過度升高，使其與微管的結(jié)合能力降低，從而互相聚集形成具有神經(jīng)毒性的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，進(jìn)而通過異常復(fù)雜的機(jī)制誘發(fā)神經(jīng)元變形最終引發(fā)老年癡呆[11]。在Aβ刺激下，過度磷酸化的tau蛋白在成對(duì)螺旋絲上急劇增加，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞骨架失穩(wěn)和記憶功能障礙[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ刺激tau蛋白過度磷酸化的機(jī)制與Aβ引發(fā)氧化應(yīng)激效應(yīng)相關(guān)[13-14]。Aβ的神經(jīng)毒性由氧自由基和氧自由基清除劑來介導(dǎo)和調(diào)節(jié)，過度聚合的Aβ?lián)p害神經(jīng)細(xì)胞，并促使氧自由基生成增加，而抗氧化物質(zhì)SOD水平下降，MDA水平上升，SOD是重要的氧自由基清除劑之一。

本研究顯示首先利用Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立體外AD模型，給予原花青素干預(yù)來檢測(cè)氧化應(yīng)激水平，結(jié)果顯示原花青素可明顯升高抗氧化物質(zhì)SOD的水平，且降低MDA的水平。氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的RCAN1酶水平增加，這種鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白會(huì)促使Tau蛋白磷酸化。

本研究顯示原花青素可通過抑制Ser396位點(diǎn)tau蛋白的過度磷酸化來保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免于Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，tau蛋白在Ser396位點(diǎn)處的過度磷酸化可引起成對(duì)螺旋絲狀A(yù)D樣聚集體和微管細(xì)胞骨架的不穩(wěn)定，并會(huì)誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的死亡和區(qū)域特異性神經(jīng)變性[15]。因此，原花青素對(duì)該位點(diǎn)tau蛋白過度磷酸化的抑制可能與其發(fā)揮對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用有關(guān)。

Tau蛋白發(fā)生過度磷酸化主要由體內(nèi)蛋白激酶引起，其中絲裂原活化蛋白激酶(miotgen-activated protein kinase，MAPK)作為一種脯氨酸蛋白激酶發(fā)揮著重要作用。體外試驗(yàn)中證實(shí)，在Aβ處理后的神經(jīng)元中，MAPK被激活，并引起tau蛋白過度磷酸化。p38是MAPK途徑的重要組成部分之一，本研究結(jié)果表明原花青素可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)水平，為了確認(rèn)原花青素是否可通過p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抑制tau蛋白磷酸化作用，我們選擇p38 MAPK通路的特異性抑制劑SB203580進(jìn)一步研究p38 MAPK信號(hào)通路在原花青素抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化中的作用。SB203580是廣泛應(yīng)用于p38信號(hào)通路的阻斷劑。研究顯示p38阻斷劑的應(yīng)用可顯著改善Aβ25-35介導(dǎo)的細(xì)胞神經(jīng)毒性[16-17]，Aβ可激活p38 MAPK引起神經(jīng)系統(tǒng)中tau蛋白的過度磷酸化[18]，那么是否可抑制p38 MAPK通路激活從而改善Aβ25-35介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白的過度磷酸化。為此，我們進(jìn)一步做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)抑制劑組tau蛋白磷酸化水平無明顯改變，原花青素與p38阻斷劑應(yīng)用組均可引起tau蛋白磷酸化水平的下調(diào)，且降低程度無明顯差異，所以p38 MAPK活性的調(diào)節(jié)可能對(duì)原花青素減輕Aβ誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

本研究證實(shí)了原花青素對(duì)Aβ25-35介導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其可能是通過抑制p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)，該結(jié)果提高了我們對(duì)原花青素具有神經(jīng)保護(hù)作用的認(rèn)知，為進(jìn)一步研究老年神經(jīng)退行性疾病的防治也提供了新思路。