枸杞多糖對(duì)酒精性肝損傷小鼠腎臟的保護(hù)作用

魏芬芬，王文娟，張 波*

(北京聯(lián)合大學(xué)健康與環(huán)境學(xué)院，北京 100191)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有4%的死亡與酗酒有關(guān)，過(guò)量飲酒已經(jīng)成為全世界的一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題。肝臟是酒精代謝的主要器官，但腎臟作為乙醇的排泄器官，酒精攝入后約有10%的酒精會(huì)在腎臟進(jìn)行代謝。已有研究表明，腎臟中也存在乙醇代謝的關(guān)鍵酶(乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶)，因此可以推斷乙醇在腎臟中的代謝途徑可能與肝臟類似，而乙醇在腎臟代謝過(guò)程中可能也會(huì)對(duì)腎臟造成損傷[1]。

枸杞屬于茄科、枸杞屬植物，是我國(guó)一種名貴的藥食同源植物，在《神農(nóng)本草》中記錄其具有滋肝補(bǔ)腎、益精明目等功效[2]。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)則是枸杞的主要活性成分[3]，已被證實(shí)具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等活性。枸杞多糖對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用已有許多研究，并且研究表明枸杞多糖可以通過(guò)增強(qiáng)肝臟的抗氧化作用，增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激能力，從而減輕酒精對(duì)肝臟的損害[4]。同理，既然腎臟作為乙醇最大的排泄器官，同時(shí)也負(fù)責(zé)代謝小部分乙醇，那么乙醇對(duì)腎臟是否也會(huì)產(chǎn)生類似肝臟的損傷作用，枸杞多糖對(duì)于腎臟的損傷是否也具有保護(hù)作用？基于以上疑問(wèn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立酒精性肝損傷小鼠模型，研究枸杞多糖對(duì)小鼠酒精性腎損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 枸杞多糖經(jīng)水提醇沉工藝，最終獲得純度為60%的枸杞多糖，粉末狀，由中國(guó)科學(xué)院蘭州物理化學(xué)研究所提供；無(wú)水乙醇(分析純)購(gòu)于北京化工廠；丙二醛(malondialdehyde，MDA；批號(hào)201709027)、還原型谷胱甘肽(glutathione peroxidase，GSH；批號(hào)20171130)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號(hào)20170815)以及考馬斯亮藍(lán)(批號(hào)20170812)均購(gòu)于南京建成生物工程所；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號(hào)201609)和小鼠白介素-1β(IL-1β，批號(hào)201609)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海滬尚生物科技有限公司。德國(guó)Eppendorf公司5804R型低溫高速離心機(jī)；上海一恒科學(xué)儀器有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱；常州朗越儀器制造有限公司電動(dòng)勻漿器；日本津島儀器有限公司UV-2450紫外可見分光光度計(jì)；日本日立高新技術(shù)公司7180型全自動(dòng)生化分析儀；上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司FA2104N型電子天平；日本奧林巴斯有限公司cx23生物顯微鏡。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)室條件：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(京)2012-0031，溫度控制在(20±2)℃之間，空氣相對(duì)濕度50%～70%，光照設(shè)定為12 h/12 h明暗交替，自由攝食和飲水，每日更換墊料。分籠飼養(yǎng)，飼料充足，飲水不限，適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)3 d后用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠酒精性損傷模型的建立 60只昆明小鼠適應(yīng)性飼喂3 d后，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、枸杞多糖低(75 mg/kg)、中(150 mg/kg)、高(300 mg/kg)劑量組，本劑量設(shè)置時(shí)根據(jù)藥典中，枸杞的人體推薦劑量6～12 g/d設(shè)置。第1～9天，枸杞多糖各劑量組每天經(jīng)口灌胃受試物(20 mL/kg)，正常對(duì)照組和模型組則給予等體積雙蒸水。第10～16天，在灌胃受試物4 h后，枸杞多糖組和模型組小鼠均經(jīng)口灌胃給予50%(V/V)濃度酒精進(jìn)行造模，灌胃體積為12 mL/kg，正常對(duì)照組小鼠則給予等量雙蒸水。

1.2.2 樣品的收集與指標(biāo)檢測(cè) 末次灌胃后，各組小鼠禁食不禁水16 h。稱量體質(zhì)量，摘眼球取血，血漿靜置30 min后，于4 000 r/min室溫離心15 min，分離血清置于1.5 mL離心管中，4℃保存。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟指數(shù)的計(jì)算 解剖取得小鼠兩側(cè)腎臟后，迅速用預(yù)冷的0.9%的生理鹽水沖凈表面浮血，濾紙拭干，稱取質(zhì)量，用于制備10%(V/V)腎臟組織勻漿液保存待測(cè)。按照此公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)小鼠的腎臟指數(shù)：腎臟指數(shù)/%=小鼠腎臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

1.2.4 血清生化指標(biāo)的檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中葡萄糖(glucose，GLU)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，CREA)的濃度。

1.2.5 腎臟組織氧化指標(biāo)檢測(cè) 取10%(V/V)腎臟組織勻漿液，分別測(cè)定腎臟組織中SOD、GSH和MDA，均按照SOD、GSH、MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 炎性因子檢測(cè) 取10%(V/V)腎臟組織勻漿液，用ELISA試劑盒測(cè)定腎臟組織中TNF-α和IL-1β的濃度，均按照小鼠腫瘤壞死因子-α和小鼠白細(xì)胞介素-1β試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以xˉ±s表示，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。圖片處理采用OringinPro 2017軟件。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對(duì)酒精性損傷小鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

為了監(jiān)測(cè)酒精對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響，各組體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量以及腎臟指數(shù)如表1所示。由表1可見，各組實(shí)驗(yàn)小鼠初始體質(zhì)量無(wú)明顯差異，各劑量組小鼠在灌胃枸杞多糖期間體質(zhì)量也正常增長(zhǎng)，體質(zhì)量與正常對(duì)照組小鼠無(wú)明顯差異，表明枸杞多糖攝入對(duì)小鼠食欲健康等無(wú)明顯影響。從實(shí)驗(yàn)第10天起，給予劑量組和模型組酒精干預(yù)，在酒精干預(yù)前，各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異。而在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.01)，表明實(shí)驗(yàn)小鼠在大量攝入酒精后，小鼠食欲受到影響，健康狀態(tài)欠佳，導(dǎo)致體質(zhì)量下降。與模型組相比，枸杞多糖各劑量組體質(zhì)量均升高，中劑量組則顯著升高(P＜0.05)，表明在枸杞多糖的干預(yù)下，酒精對(duì)小鼠健康的損害程度得到一定緩解。同時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腎臟指數(shù)顯著上升(P＜0.01)，表明實(shí)驗(yàn)小鼠在受到酒精長(zhǎng)期刺激后，腎臟發(fā)生腫脹，因此腎臟指數(shù)升高。與模型組相比，枸杞多糖各劑量組腎臟指數(shù)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，表明枸杞多糖能夠緩解酒精對(duì)腎臟造成的損傷。

表1 枸杞多糖對(duì)小鼠體脂率及腎臟指數(shù)的影響

2.2 枸杞多糖對(duì)酒精性損傷小鼠血清GLU、BUN以及CREA的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清GLU、UREA以及CRE濃度顯均著升高(P＜0.01)，表明模型組小鼠腎臟在受到大量酒精刺激后，腎臟發(fā)生了損傷。與模型組相比，中劑量組和高劑量組小鼠血清GLU濃度顯著降低(P＜0.05)；低劑量組和高劑量組UREA濃度均顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)；高劑量組CREA濃度顯著下降(P＜0.05)，表明在枸杞多糖干預(yù)下，實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟損傷得到一定緩解。

表2 枸杞多糖對(duì)小鼠血清GLU、BUN、CREA濃度的影響

2.3 枸杞多糖對(duì)酒精性損傷小鼠腎臟SOD、GSH、MDA的影響

酒精及其代謝物會(huì)在體內(nèi)引起一系列的氧化損傷，為了檢測(cè)酒精對(duì)腎臟的氧化損傷程度，我們測(cè)定了腎臟中的SOD、GSH以及MDA。由表3可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的SOD和GSH均顯著降低(P＜0.01)，MDA濃度顯著升高(P＜0.01)，表明酒精的刺激，引起腎臟發(fā)生了氧化損傷，導(dǎo)致SOD和GSH均下降，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量上升。與模型組相比，高劑量組的SOD活力顯著升高(P＜0.01)，3個(gè)劑量組的GSH含量顯著升高(P＜0.01)，MDA含量顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞多糖對(duì)由酒精引起的氧化損傷具有一定的緩解作用，其中，對(duì)增強(qiáng)GSH和降低MDA含量比增強(qiáng)SOD活力的作用更明顯。

表3 枸杞多糖對(duì)小鼠腎臟SOD、GSH、MDA的影響

2.4 枸杞多糖對(duì)酒精性損傷小鼠腎臟TNF-α和IL-1β的影響

TNF-α和IL-1β作為兩個(gè)重要的促炎因子，在酒精性損傷過(guò)程中被當(dāng)作反映炎癥損傷程度的重要指標(biāo)。由表4可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腎臟TNF-α和IL-1β濃度顯著升高(P＜0.01)，表明模型組小鼠腎臟經(jīng)酒精刺激后，發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，各劑量組TNF-α濃度顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組的IL-1β濃度顯著降低(P＜0.05)，低劑量和中劑量降低不明顯(P＞0.05)，這表明枸杞多糖對(duì)改善炎癥反應(yīng)有明顯的效果，且對(duì)TNF-α的清除能力要強(qiáng)于IL-1β。

3 討論

目前，飲酒過(guò)量已成為全球最嚴(yán)重的健康衛(wèi)生問(wèn)題之一。全球大部分國(guó)家都在努力降低酒精的使用量，以減少酒精對(duì)健康的危害。研究表明，酒精對(duì)機(jī)體的危害主要是由于酒精及其代謝產(chǎn)物會(huì)在體內(nèi)發(fā)生一系列的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂及細(xì)胞凋亡等，對(duì)組織器官造成損害[5-6]。肝臟是酒精代謝的主要器官，酒精性肝損傷也一直是人們的研究熱點(diǎn)。但相關(guān)研究表明，腎臟也負(fù)擔(dān)著約10%的酒精代謝[7]，而腎臟中同樣存在著類似于肝臟的酒精代謝途徑即乙醇在乙醇脫氫酶的作用下，轉(zhuǎn)變成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變成乙酸，最終排出體外[8]。那么在腎臟代謝乙醇的過(guò)程中，乙醇及其代謝產(chǎn)物同樣會(huì)對(duì)腎臟產(chǎn)生一定的損害。

體質(zhì)量變化和臟器指數(shù)是評(píng)估機(jī)體健康狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)小鼠在連續(xù)灌胃酒精后，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低，腎臟指數(shù)顯著升高，表明模型組小鼠在連續(xù)受到酒精刺激后，食欲及消化吸收功能受到影響，導(dǎo)致體質(zhì)量下降，腎臟發(fā)生腫脹或者脂肪浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎臟指數(shù)上升。各劑量組與模型組相比，體質(zhì)量顯著回升，腎臟指數(shù)顯著下降，表明枸杞多糖對(duì)酒精性損傷小鼠的健康有一定保護(hù)作用。血清中葡萄糖(GLU)濃度受到多種因素調(diào)節(jié)，其中腎臟對(duì)其也具有一定調(diào)節(jié)功能，主要是通過(guò)腎小管和集合管的重吸收作用發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9]，而血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)是臨床上評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)，當(dāng)血清中GLU、BUN和CREA濃度升高時(shí)，則表明腎功能可能出現(xiàn)異常。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠GLU、BUN和CREA濃度顯著高于正常對(duì)照組，提示酒精可能造成了小鼠的腎功能損傷，如腎小管的重吸收能力以及腎小球?yàn)V過(guò)功能受到影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王楠等[1]的研究一致，即乙醇長(zhǎng)期刺激對(duì)小鼠腎功能的確有影響。與模型組相比，各劑量組小鼠GLU、BUN和CREA濃度均降低，表明枸杞多糖對(duì)腎功能損傷具有一定保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是酒精性損傷的機(jī)制之一。乙醇及其代謝產(chǎn)物刺激機(jī)體產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)攻擊機(jī)體正常的細(xì)胞，如攻擊細(xì)胞膜內(nèi)的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA增加，并通過(guò)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使活性氧的攻擊性更強(qiáng)。SOD是體內(nèi)清除超氧陰離子自由基最有效的抗氧化酶，可直接將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，達(dá)到清除自由基的目的。GSH能夠較好地清除體內(nèi)多余的H2O2、LOOH等，是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)之一[10]。同時(shí)，足量的GSH也能夠增強(qiáng)對(duì)乙醇及其代謝物的解毒能力[11]。SOD和GSH構(gòu)成了機(jī)體防御自由基攻擊的重要屏障，他們通過(guò)清除超氧陰離子自由基并終止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在抵抗氧化損傷中起了重要作用[12]。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可以反映機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，從而間接反映機(jī)體受自由基攻擊的程度[13-14]。已有研究表明，枸杞多糖與黃芪多糖聯(lián)用可以升高GSH和降低MDA含量[14]，鐵皮楓斗多糖[15]能夠提高SOD活性，黑牛肝菌多糖[12]和香菇多糖[16]均能顯著提高SOD與GSH含量，使MDA含量顯著降低。與上述多糖類似，本實(shí)驗(yàn)中，枸杞多糖能夠顯著提高SOD和GSH含量，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量，表明枸杞多糖具有良好的抗氧化活性，能夠有效抵抗由酒精引起的機(jī)體的氧化損傷。

炎癥反應(yīng)作為酒精性損傷的機(jī)制之一，也一直被人們所研究。乙醇在腎臟的代謝與排泄過(guò)程中，也會(huì)刺激腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)。其中腫瘤壞死因子TNF-α和白細(xì)胞介素IL-1β是兩個(gè)重要的促炎因子，在炎癥反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。TNF-α可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性因子，從而促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。IL-1β能夠誘導(dǎo)其他的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子等的分泌，是炎癥反應(yīng)中重要的促炎因子[18]。除了可以直接作用，IL-1β還通過(guò)聯(lián)合其他促炎癥因子共同發(fā)揮作用，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生“炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)”，加重炎癥損傷[19]。在本研究中，模型組小鼠TNF-α和IL-1β濃度顯著升高，表明由于酒精的刺激，小鼠腎臟發(fā)生了炎癥損傷。各劑量組與模型組相比，二者濃度均顯著降低，提示枸杞多糖能夠降低炎性因子濃度，減輕炎癥損傷。

綜上所述，枸杞多糖對(duì)酒精致小鼠腎臟損傷具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、減少自由基的產(chǎn)生、減輕炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮作用，但其具體作用機(jī)制還有待下一步研究。

(致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院蘭州物理化學(xué)研究所提供的枸杞多糖，感謝北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)設(shè)備)