2種方法測(cè)定氧化銅納米顆粒對(duì)新生大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性的比較研究

張麗霞，顧 雯，張宏偉，段 鏈*

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所毒理室，北京 100021)

納米銅是代表性的金屬納米材料之一，作為商業(yè)化產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)多年，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有望代替銅化合物或微米銅材料而得到廣泛應(yīng)用。然而，已有研究表明納米粒子所具有的小尺寸、大的比表面積及高表面活性等特征使其具有一些可能的健康危害[1-2]。納米銅在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中均顯示出毒性作用[3]。研究表明氧化銅納米顆粒(CuO-NPs)可能影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[4-5]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)是一種薄而扁平、內(nèi)襯在大腦毛細(xì)血管內(nèi)壁且與血液直接接觸的磷狀細(xì)胞。由BMECs組成的大腦微血管構(gòu)建出高選擇性的屏障，很大程度上決定了各種物質(zhì)對(duì)血腦屏障的通透程度。BMECs之間通過(guò)其細(xì)胞膜側(cè)壁相關(guān)聯(lián)，接觸面上有緊密連接蛋白和粘附蛋白[6-7]。BMECs擁有特殊的基底膜結(jié)構(gòu)，是維持血腦屏障的重要部件[8]。作為血腦屏障的主要組成部分之一，BMECs被認(rèn)為是血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)物質(zhì)相互交換的主要場(chǎng)所，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著十分重要的作用。

細(xì)胞毒性測(cè)定是一種最直接反映體外培養(yǎng)細(xì)胞損傷的指標(biāo)，也是研究外源化學(xué)物質(zhì)毒作用機(jī)制的最關(guān)鍵步驟。刃天青是常用的一種細(xì)胞毒性檢測(cè)劑，在細(xì)胞增殖過(guò)程中將無(wú)熒光性的刃天青還原為熒光產(chǎn)物，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)所得的熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)成正比[9]。實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(real time cell analyze，RTCA)是一種新興的監(jiān)測(cè)活細(xì)胞狀態(tài)的方法[10]，RTCA基于微電子阻抗技術(shù)利用細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)反映細(xì)胞活性，可根據(jù)需要進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定。檢測(cè)記錄的CI值為無(wú)量綱單位，可反映貼壁細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)及粘附能力等特征。

本研究利用RTCA法和刃天青法測(cè)定CuO-NPs對(duì)BMECs的毒性，比較兩種方法用于納米顆粒毒性測(cè)定的優(yōu)劣勢(shì)，分析RTCA法用于納米顆粒細(xì)胞毒性測(cè)定的適用性。同時(shí)獲得CuO-NPs作用于BMECs所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性結(jié)果，為進(jìn)一步深入研究金屬納米顆粒的對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器

連續(xù)波長(zhǎng)微孔板分光光度計(jì)(Multiskan GO，美國(guó)Thermo公司)；Real-Time Cell Analyzer及配套16孔板由艾森生物有限公司[ACEA生物(杭州)有限公司]生產(chǎn)，此配套16孔板每孔底面積0.32 cm2，與常規(guī)96孔板規(guī)格一致；Zxis 165 X射線光電子能譜(XPS)系統(tǒng)(Kratos Analytical)；JEM-2100F透射電子顯微鏡(TEM)(JEOL Ltd.Japan)；納米粒度Ζ電位儀(Malvern Instruments.Ltd.，UK)。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

新生SD大鼠(出生后24 h)購(gòu)自中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所(生產(chǎn)許可證SCXK2014-0013)。在分離培養(yǎng)BMECs之前確保所有的工具無(wú)菌，所有操作都在冰上進(jìn)行，用無(wú)菌的多聚賴(lài)氨酸包被所需材料(12孔培養(yǎng)皿)。在解剖顯微鏡下，用一對(duì)小鑷子將新生SD大鼠帶有海馬和皮層的大腦與頭骨分離，然后放入盛有冰冷HBSS的培養(yǎng)皿中，將大腦兩半球分開(kāi)，用鑷子將多余的腦膜剝離，并分離海馬和大腦皮層。用冰冷的HBSS清洗兩次。分離的大腦皮層通過(guò)200和70μm的篩網(wǎng)均勻化，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞隨濾液棄除，70μm篩網(wǎng)上存留的大部分即為BMECs。70μm篩網(wǎng)上存留物在37℃下用II型膠原酶(0.2%)消化20 min。消化后，室溫下200 g離心5 min，收集微血管碎片并接種到聚-D-賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)皿上，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(Gibco，USA)，其中含有10%胎牛血清(FCS，Gibco，USA)、30μg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Sigma)和1%雙抗，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)，用1.25 mg/mL的胰酶進(jìn)一步純化，并經(jīng)2～4代傳代純化后，得純化的BMECs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 納米粒子

1.3.1 納米氧化銅顆粒的表征 納米氧化銅(CuONP，純度99%)購(gòu)自DK(北京)納米技術(shù)有限公司。根據(jù)制造商的規(guī)格，粒徑為10～100 nm，體積密度為0.79 g/cm3，質(zhì)量濃度為30%，比表面積為13.1 m2/g，以分散在去離子水中的懸浮液形式獲得納米顆粒。使用X射線光電子能譜(XPS)測(cè)定納米顆粒的元素組成。用JEM-2100F透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒的形狀。

將納米氧化銅顆粒加入到BMECs培養(yǎng)液中，使其終濃度為最高染毒濃度，輕輕旋轉(zhuǎn)并吹打，以確保顆粒完全分散，用納米粒度Ζ電位儀測(cè)定高濃度受試物的Ζ電位，同時(shí)以動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定其水合粒徑，以確定染毒后納米氧化銅的團(tuán)聚情況。

1.3.2 納米顆粒分散體 使用130 W超聲波處理器(Cole-Parmer Instruments，Vernon Hills，IL)將所有分散體以70%振幅超聲處理5 min。測(cè)定其pH值(pH值穩(wěn)定在6～7即可)。在4℃下儲(chǔ)存分散體至少24 h，并在使用前立即超聲處理5 min。

1.4 RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)測(cè)定細(xì)胞毒性

1.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMECs細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)液充分混勻，按不同密度接種于RTCA配套16孔板中，每孔50μL。細(xì)胞濃度梯度分別設(shè)置為 1.56×102、3.13×102、6.25×102、1.25×103、2.50×103、5.00×103和1.00×104個(gè)/mL，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔。RTCA程序設(shè)置15 min進(jìn)行一次細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)值的測(cè)試。CI值為RTCA以基于微電子阻抗的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)的細(xì)胞指數(shù)單位，為無(wú)量綱單位，所代表的是成活的貼壁細(xì)胞。通過(guò)對(duì)不同密度的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，以細(xì)胞CI值為Y軸，以時(shí)間為X軸繪制生長(zhǎng)曲線，通過(guò)比較生長(zhǎng)曲線斜率判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，確定適合于毒性實(shí)驗(yàn)的最終細(xì)胞濃度進(jìn)行下一步毒性實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)CuO-NPs細(xì)胞毒性 根據(jù)已繪制出的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度接種于配套16孔板中，每孔100μL。置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)約24 h后進(jìn)行染毒。CuONPs設(shè)置5個(gè)不同染毒劑量及空白對(duì)照組，分別為1.5、0.75、0.38、0.19、0.09、0 mg/mL，每個(gè)劑量設(shè)2個(gè)復(fù)孔。

RTCA程序設(shè)置為細(xì)胞接種后自然生長(zhǎng)，每15 min測(cè)定一個(gè)點(diǎn)，測(cè)定自細(xì)胞接種時(shí)為起始點(diǎn)，第100小時(shí)測(cè)定結(jié)束。以時(shí)間為X軸，歸一細(xì)胞指數(shù)(normalized cell index，NCi)值為Y軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察不同劑量CuO-NPs所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)將染毒時(shí)刻作為校正時(shí)間點(diǎn)，NCi值為1，之后各時(shí)間點(diǎn)各濃度的CI值均與染毒時(shí)刻相比，按下式計(jì)算求得NCi值。

式中：NCi——?dú)w一細(xì)胞指數(shù)；CI(Tk)——染毒前最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞指數(shù)；CI(Ti)——被測(cè)定的時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞指數(shù)；N——所有被測(cè)定時(shí)間點(diǎn)。

1.5 刃天青法測(cè)定納米氧化銅的細(xì)胞毒性

根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，選擇與RTCA法相同的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔100μL。置于37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，飽和濕度下培養(yǎng)約24 h后進(jìn)行染毒。納米氧化銅染毒劑量組與RTCA法一致，每個(gè)劑量設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。共接種5塊96孔板，分別在染毒3、12、24、36和48 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。染毒時(shí)間到達(dá)確定時(shí)間點(diǎn)后，各孔加入配制好的刃天青溶液，10μL/孔，終濃度為5μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用連續(xù)波長(zhǎng)微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)530 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)590 nm。細(xì)胞存活率/%=×

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CuO-NPs的表征

透射電子顯微鏡圖像顯示CuO-NPs是不規(guī)則形狀的晶體形式(圖1)。XPS分析顯示CuO-NPs由Cu和O組成。將CuO-NPs加入到BMECs完全培養(yǎng)液中，終濃度為最高染毒濃度1.5 mg/mL，Ζ電位測(cè)定結(jié)果表明，CuO-NPs在BMECs培養(yǎng)液中的Ζ電位為(-36.5±6.59)mv，水合粒徑為(189.12±25.68)nm。CuO-NP樣品在培養(yǎng)基中的Ζ電位絕對(duì)值較大，說(shuō)明樣品在培養(yǎng)基中的懸浮相對(duì)穩(wěn)定。水合粒徑結(jié)果表明，CuO納米顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)基中均形成團(tuán)聚。其他關(guān)于納米顆粒的研究中也得到類(lèi)似結(jié)果[11-12]。

圖1 CuO-NP的透射電子顯微鏡圖像結(jié)果

2.2 RTCA法測(cè)定BMECs細(xì)胞毒性

2.2.1 細(xì)胞增殖的測(cè)定 本研究對(duì)BMECs進(jìn)行細(xì)胞增殖分析以獲得細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的最佳細(xì)胞接種數(shù)及最佳染毒時(shí)間。結(jié)果如圖2所示，以15 min的間隔觀察細(xì)胞特征，垂直藍(lán)線表示細(xì)胞粘附和擴(kuò)展的初始階段，紅線表示接種后的不穩(wěn)定狀態(tài)，在細(xì)胞接種的初始階段(0～20 h)BMECs的CI值增加，這可能與細(xì)胞的附著和粘附有關(guān)，隨后達(dá)到短暫的平臺(tái)期。接后種40 h開(kāi)始，CI值又逐漸升高，說(shuō)明細(xì)胞從這個(gè)時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始大量增殖，進(jìn)入快速生長(zhǎng)期。因此，后續(xù)試驗(yàn)研究建議在BMECs接種后40 h作為染毒時(shí)間點(diǎn)。

圖2 BMECs生長(zhǎng)曲線

另外，1.0×104和5.0×103個(gè)/孔的兩組細(xì)胞CI曲線隨著時(shí)間的增加顯示下降趨勢(shì)。這可能是由于高密度BMECs會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。2.5×103個(gè)/孔細(xì)胞在染毒時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞CI值快速增加并在受試時(shí)間內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期，說(shuō)明此細(xì)胞數(shù)量在受試時(shí)間內(nèi)處于快速增殖期并達(dá)到穩(wěn)定。從1.25×103及2.5×102個(gè)/孔兩組細(xì)胞CI值生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)，到受試時(shí)間內(nèi)該兩組細(xì)胞一直處于增殖階段，說(shuō)明此兩組細(xì)胞數(shù)量不足，在快速生長(zhǎng)期內(nèi)沒(méi)有到達(dá)快速增殖狀態(tài)。因此，選擇每孔2.5×103個(gè)細(xì)胞作為細(xì)胞染毒的最佳數(shù)量。

2.2.2 細(xì)胞毒性測(cè)定 每孔選擇2.5×103個(gè)BMECs細(xì)胞作為細(xì)胞染毒的最佳接種數(shù)量，接種后約40 h進(jìn)行染毒。以時(shí)間為X軸，歸一細(xì)胞指數(shù)(NCi)值為Y軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察不同劑量CuO-NPs所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，如圖3所示。結(jié)果顯示BMECs在0.38、0.75、1.5 mg/mL染毒后2～3 h引起瞬間不穩(wěn)定，之后是漸進(jìn)死亡，這可能是由于納米顆粒本身的特征，如擴(kuò)散后沉積、團(tuán)聚等，導(dǎo)致其進(jìn)入大分子的細(xì)胞培養(yǎng)體系后而產(chǎn)生的影響，而非毒性作用所致。此外，0.75、1.5 mg/mL組BMECs的NCi值在染毒后約2 h開(kāi)始降低并在4 h內(nèi)降至約0。其他染毒劑量組的毒性效應(yīng)曲線可觀察到近似劑量依賴(lài)性趨勢(shì)。

圖3 RTCA測(cè)定CuO-NPs對(duì)BMECs的細(xì)胞毒性

2.3 刃天青法測(cè)定CuO-NPs的細(xì)胞毒性

為了比較從RTCA系統(tǒng)獲得的結(jié)果，在染毒3、12、24、36和48 h時(shí)，通過(guò)刃天青法測(cè)量細(xì)胞活力。不同染毒時(shí)間下的細(xì)胞活力見(jiàn)圖4。BMECs暴露于1.5和0.75 mg/mL的CuO-NPs時(shí)所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性最大。CuO-NP劑量0.09 mg/mL染毒24 h以?xún)?nèi)、0.19 mg/mL染毒3 h細(xì)胞活力與對(duì)照組(0 mg/mL)無(wú)顯著差異，其它受試劑量組各染毒時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。并且各染毒劑量組可觀察到劑量依賴(lài)性細(xì)胞毒性?？梢?jiàn)刃天青法測(cè)定結(jié)果與RTCA獲得的結(jié)果相似。

圖4 刃天青法測(cè)定CuO-NPs的細(xì)胞毒性

2.4 RTCA及刃天青法所測(cè)CuO-NPs對(duì)于BMECs細(xì)胞IC50值的比較

本研究在兩種毒性測(cè)定方法中都觀察到類(lèi)似的劑量依賴(lài)性，因此選擇相同的暴露時(shí)間點(diǎn)(染毒3、12、24、36、48 h)計(jì)算其IC50值。RTCA方法通過(guò)RTCA分析系統(tǒng)計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的IC50值及回歸系數(shù)R2，刃天青法通過(guò)擬合曲線計(jì)算Logistic回歸系數(shù)R2值。結(jié)果如表1所示。

利用SPSS 16.0軟件將兩種方法在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的BMECs細(xì)胞IC50值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析顯示兩種方法所得IC50值相關(guān)系數(shù)為0.999，P=0.000，具有相關(guān)性。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.125，P=0.323)。從計(jì)算IC50的R2值來(lái)看，RTCA擬合曲線R2值高于刃天青法Logistic回歸系數(shù)R2值。

表1 兩種方法檢測(cè)CuO-NPs作用于BMECs不同暴露時(shí)間的IC50值及R 2值

3 討論

細(xì)胞毒性測(cè)定是外源性化學(xué)物質(zhì)體外機(jī)制研究的關(guān)鍵，也是毒性效應(yīng)研究的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)采用2種毒性測(cè)定方式相比較的方法，研究納米氧化銅對(duì)原代BMECs細(xì)胞的毒性作用，以探討適用于納米顆粒物的細(xì)胞毒性測(cè)定方法。

而納米材料本身具有體積效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等特殊的物理特性，可能產(chǎn)生特有的細(xì)胞毒性作用[13]。常規(guī)的細(xì)胞毒性測(cè)定方法所得結(jié)果為某一個(gè)或幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值，用于測(cè)定粒徑僅為1～100 nm范圍的納米粒子，可能會(huì)出現(xiàn)忽略納米材料作用于細(xì)胞毒性變化過(guò)程的情況。而RTCA是一種實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)，它基于微電子阻抗原理，反映細(xì)胞活性的無(wú)標(biāo)記連續(xù)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞狀態(tài)，不受受試物本身形態(tài)的影響，可避免納米顆粒物易團(tuán)聚而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。另外，RTCA技術(shù)可根據(jù)需要進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，反映貼壁細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)及粘附能力等特征的綜合指數(shù)，可反映整個(gè)毒性作用過(guò)程的變化情況。然而，RTCA方法是一種新興的細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)，其應(yīng)用于納米顆粒毒性測(cè)定的適用性及準(zhǔn)確性還需經(jīng)過(guò)多方面驗(yàn)證。因此本研究將RTCA方法與目前已被認(rèn)可的常用的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法刃天青法進(jìn)行比較。從分析結(jié)果中可以看出，兩種方法所獲得IC50值相關(guān)系數(shù)為0.999，P=0.000，具有相關(guān)性。通過(guò)配對(duì)t檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)此兩種方法的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明這兩種方法所得毒性結(jié)果在趨勢(shì)上具有一致性，RTCA方法適合于納米顆粒的細(xì)胞毒性測(cè)定。并且從計(jì)算IC50擬合曲線的R2值來(lái)看，RTCA擬合曲線R2值高于刃天青法Logistic回歸系數(shù)R2值，說(shuō)明RTCA所得結(jié)果更為精確。另外，RTCA方法可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)到細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、提供動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)、并可以觀測(cè)到細(xì)胞毒性開(kāi)始的起始點(diǎn)及整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中的變化，更為詳細(xì)、準(zhǔn)確的提供毒性數(shù)據(jù)結(jié)果，因此相比于經(jīng)典的細(xì)胞毒性測(cè)試方法，更具優(yōu)勢(shì)。

本研究通過(guò)RTCA對(duì)不同接種濃度的BMECs進(jìn)行細(xì)胞增殖分析，建立了BMECs完整生長(zhǎng)周期的生長(zhǎng)曲線，獲得了細(xì)胞進(jìn)行快速生長(zhǎng)期的時(shí)間點(diǎn)并篩選出最佳接種濃度，確定后續(xù)試驗(yàn)研究的染毒時(shí)間為接種后40 h，最佳接種濃度為2.5×103個(gè)/孔，對(duì)于后續(xù)研究CuO-NP對(duì)血腦屏障功能影響的機(jī)制研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支撐。