豬糞便沼液中多種抗生素殘留量的LC-MSMS檢測(cè)

王光杰，徐麗娜，楊 玲，姜潔露，李 鈞，曲潔靜

（山東同濟(jì)測(cè)試科技股份有限公司，山東煙臺(tái)264004）

在最近幾十年中，獸用抗生素使用量驚人，大量的飼用抗生素作為飼料添加劑長(zhǎng)期使用，動(dòng)物經(jīng)排泄進(jìn)入糞便、沼液中，造成藥物殘留和耐藥基因的產(chǎn)生，包括動(dòng)物致病菌和內(nèi)在微生物菌群，進(jìn)而對(duì)人類染病的醫(yī)治和微生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在威脅，同時(shí)獸用抗生素在肉、蛋、乳等動(dòng)物產(chǎn)品中殘留通過(guò)一般的食品烹飪方法不能完全使其分解，從而對(duì)人產(chǎn)生毒副作用和耐藥性。

據(jù)研究報(bào)道，對(duì)可食用動(dòng)物使用的抗生素有25%～75%以母體藥物的形式從糞尿中排出體外，并且在土壤中長(zhǎng)期滯留[1]。有相當(dāng)比例的獸藥抗生素以母體藥物或代謝產(chǎn)物的形式通過(guò)禽畜糞尿進(jìn)入水體和土壤中，從而對(duì)環(huán)境造成了潛在威脅。

目前，抗生素的含量測(cè)定方法有微生物法、高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法及高效液相色譜法[2-3]等。試驗(yàn)選擇獨(dú)特的樣品處理方法，建立了一種快速、準(zhǔn)確、分離度好的高效液相色譜質(zhì)譜法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters H-class型與AB SCIEX API 4000 Plus型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI源）；SPE固相萃取裝置；氮吹儀；分析天平：感量分別為0.001 g和0.000 01 g；高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min；冷凍干燥機(jī)等。

1.2 主要試劑耗材

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)于壇墨質(zhì)檢、Sigma等，純度≥98%；乙腈（色譜純），德國(guó)Merck公司提供；EDTA（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其他試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水；HLB固相萃取柱（200 g/6 L），美國(guó)Waters公司提供。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為BEH C18型（1.7 μm，2.1 mm×50 mm），柱溫40℃，進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；流速0.3 mL/min。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 檢測(cè)，霧化氣為N2。

6種抗生素主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 6種抗生素主要質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品分析步驟

1.4.1 試樣制備

樣品采自當(dāng)?shù)貍€(gè)體養(yǎng)豬場(chǎng)糞便水，靜置后取上層尿液和沼液的水樣加入3 g Na2EDTA，調(diào)節(jié)pH值至3～4后過(guò)小柱，過(guò)柱后若水樣較為渾濁或懸浮雜質(zhì)較多應(yīng)過(guò)濾處理，水樣采集后3 d內(nèi)完成檢測(cè)。

下層糞便經(jīng)-60℃凍干，準(zhǔn)確稱取0.2 g干燥脫水樣品于10 mL離心管中，加入10 mL50%的1 mmol/L EDTA甲醇溶液（pH值2），渦旋混勻1 min，超聲10 min后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，再重復(fù)萃取2次，合并所有上清液，搖勻。

1.4.2 凈化濃縮

HLB固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL Na2EDTA溶液活化，合并提取后水樣以1～2 mL/min流速過(guò)柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用10 mL 3%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干后用1 mL初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

12種抗生素MRM掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖112 種抗生素MRM掃描質(zhì)譜圖

12種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間分別為3.09，3.48，1.60，3.25，2.00，3.24，3.26，2.99，3.14，3.01，3.22，3.63 min。在豬糞便、豬尿和沼液水樣中分別添加12種藥物，以10倍信噪比（S/N） 計(jì)算，在進(jìn)樣量10 μL時(shí)，得到此方法最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.05～3.00 ng/mL。

2.2 工作曲線

將12種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至1～100 μg/L，按上述儀器條件進(jìn)行分析，以定量離子對(duì)的相應(yīng)峰面積和對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

12種抗生素線性回歸曲線及檢出限見表3。

表3 12種抗生素線性回歸曲線及檢出限

2.3 實(shí)際樣品分析

在豬糞便、豬尿和沼液水樣中添加10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收，采用外標(biāo)法定量，結(jié)果顯示12種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在水樣中的回收率為62.5%～105.2%。

12種抗生素加標(biāo)回收率見表4。

表4 12種抗生素加標(biāo)回收率/%

3 結(jié)論

建立了多種抗生素一次處理進(jìn)樣快速有效的檢測(cè)方法，在實(shí)際樣品豬糞便、豬尿和沼液水樣中添加多種抗生素平均回收率為62.5%～105.2%。該法具有快速、穩(wěn)定、靈敏、高效等特點(diǎn)，適用于環(huán)保行業(yè)對(duì)多種抗生素的檢測(cè)，可廣泛推廣于企業(yè)作為常規(guī)檢測(cè)的方法。