外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-rB活性與急性缺血性腦卒中的相關(guān)性研究

黃苗　師宏　白艷艷　康林娥

[摘要]目的探討外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中細(xì)胞核因子rcB（nuclearfactorkappaB，NF-kB）活性預(yù)測(cè)急性缺血性腦卒中（acuteischemicstroke，AIS）患者神經(jīng)功能預(yù)后的臨床價(jià)值。方法連續(xù)性納入在我院治療的74例AIS患者，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析AIS患者的PBMC中的NF-rcB活性，并與健康人群進(jìn)行對(duì)照比較。以90天改良Rankin量表（mRS）評(píng)分大于2分為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)估NF-rB活性對(duì)神經(jīng)功能預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果AIS患者的PBMC中平均NF-kB活性顯著高于健康對(duì)照人群[（28.32+8.70）%：（13.19+4.51）%，P<0.01]。預(yù)后不良組患者的PBMC中NF-rB活性顯著高于預(yù)后良好組患者[（32.60+4.82）%：（23.42+6.51）%，P<0.01]。與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組患者的年齡更高[（62.12±12.83）歲：（53.32±13.41）歲，P=0.02]、合并心房顫動(dòng)更多（35.39%：12.28%，P=0.03）、入院時(shí)NIHSS評(píng)分更高[（15.78±3.43）分：（11.23+4.51）分，P<0.01]。ROC曲線顯示PBMC中NF-kB活性對(duì)神經(jīng)功能預(yù)后不良的預(yù)測(cè)閾值為28.20%，靈敏度為87.31%、特異度為72.12%。多因素Logistics回歸分析顯示NF-cB活性>28.20%（OR=2.44，95%CI：1.78～3.92，P<0.01）和入院時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腦卒中量表（NIHSS）評(píng)分>14分（OR=1.65，95%CI：1.14～2.58，P=0.02）是影響AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論AIS患者PBMC中NF-rB活性顯著升高，并且升高的NF-rB活性與AIS患者的神經(jīng)功能預(yù)后不良獨(dú)立相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]急性缺血性腦卒中;外周血單個(gè)核細(xì)胞;細(xì)胞核因子cB

中圖分類號(hào)：R743.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-816X（2019）06-0513-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.06.008

Correlation between Nuclear Factor Kappa B （ NF-KB ） Activity in Peripheral Blood ， Mononuclear Cell and Acute Ischemic Stroke. HUANG Miao， KANG Lin-E， BAI Yan-yan. Department of Neurology， Yulin First Hospital ， Shaanxi 719000， China

[ Abstract ] Objective To investigate the clinical value of nuclear factor kappa B （ NF-KB ） activity in peripheral blood mononuclear with healthy controls. The 90-Day modified Rankin scale（ mRS ） score > 2 was set as the main evaluation indicator， and evaluated was significantly higher than that of healthy controls（ 28.32 t 8.70% vs 13.19+4.51%， P <0.01 ）. The NF-KB activity in PBMC of patients with poor prognosis was significantly higher than that of patients with well prognosis（ 32.60+4.82% vs 23.4216.51 % ， P<0.01 ）. Compared with the well prognosis group， the patients with poor prognosis were older （ 62.12t 12.83 years vs 53.32 t 13.41 years， P= 0.02）， with more atrial fibrillation （ 35.39% vs 12.28%， P =0.03 ）， and higher NIHSS score at admission （ 15.7813.43 points vs 11.2314.51， P<0.01 ）. The ROC curve showed that the predictive threshold of NF-KB activity in PBMC for poor neurological prognosis was 28 .20%， with the sensitivity of 87.31 % and specificity of 72. 12% . Multivariate logistic regres-sion analysis showed NF-KB activity > 28 .20% （ OR=2.44， 95% CI： 1.78～3.92， P<0.01 ） and NIHSS score at admission > 14.00（ OR=1.65， 95% CI： 1.14～ 2.58， P = 0.02 ） were independent risk factors for affecting the poor neurological function ofcell （ PBMC ） in predicting neurological prognosis in patients with acute ischemic stroke （ AIS ）. Methods 74 patients with AIS treated in our hospital were continuously enrolled. Flow cytometry was used to analyze NF-KB activity in PBMC of AIS patients and compared the predictive value of NF-KB activity for poor neurological prognosis. Results The mean NF-KB activity in PBMC of patients with AIS in patients with AIS. Conclusions NF-KB activity was significantly elevated in PBMC of patients with AIS， and elevated NF-KB activity was independently associated with poor neurological prognosis in patients with AIS.

[Key words ] Acute ischemic stroke; Peripheral blood mononuclear cell; Nuclear factor kappa B

急性缺血性腦卒中（acuteischemicstroke，AIS）是因大腦血容量突然減少而導(dǎo)致腦組織迅速死亡，嚴(yán)重影響患者健康和神經(jīng)功能的疾病[1].近年來(lái)的研究

提出免疫和炎癥反應(yīng)在腦卒中的疾病進(jìn)展和所有階段中起到關(guān)鍵性作用，包括腦卒中的急性發(fā)展和腦卒中后的長(zhǎng)期恢復(fù)[2]。而炎癥因子成為目前AIS研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞核因子reB（nuclearfactorkappaB，NF-kB）是一種能夠促進(jìn)多種炎癥因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，處于炎性反應(yīng)的核心位置，具有抗炎和促炎的雙重作用[3]。但外周血中NF-kB的活性改變與AIS患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系目前少見(jiàn)報(bào)道。因此本文主要探討AIS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中NF-kB的活性改變及其對(duì)預(yù)后的影響。

1資料和方法

1.1一般資料：連續(xù)性納入2017年1月至2017年12月間在我院治療的AIS患者74例，其中男38例，女36例，年齡43～83歲，平均（54.21±12.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合<中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014版>診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，經(jīng)頭顱CT或MRI檢查確診;（2）神經(jīng)功能障礙，即入院時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腦卒中量表（nationalinstituteofhealthstrokescale，NIHSS）評(píng)分>2分;（3）首次發(fā)病;（4）腦卒中發(fā)病8h以內(nèi);（5）近3個(gè)月內(nèi)未使用激素、免疫抑制劑或細(xì)胞毒性藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）外傷性腦出血、動(dòng)脈瘤或動(dòng)脈硬化、蛛網(wǎng)膜下腔出血等;（2）合并自身免疫性疾病或急慢性感染狀態(tài);（3）合并重要臟器功能障礙或衰竭。本研究同期招募了40例年齡匹配、且無(wú)腦卒中病史、無(wú)自身免疫性疾病或急慢性感染狀態(tài)的健康體檢人群作為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并經(jīng)受試者及其家屬簽署知情同意書。

1.2方法：

1.2.1PBMC中NF-kB活性檢測(cè)：AIS患者在入院后即刻抽取肘靜脈血、對(duì)照組在清晨空腹抽取靜脈血，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NF-kB活性。步驟如下：（1）制備PMBC懸浮液：取2mL經(jīng)EDTA抗凝處理的血液樣本，加入2mL溶血素，充分混勻后室溫靜置25～30min，2000r/min離心5min，共2次，棄上清，加入1mLPBS緩沖液，搖勻后加入150μLA液，靜置10min后加人150pLB液，靜置10min后重復(fù)上述步驟一遍。（2）染色：向上述制備好的PBMC懸液中加入0.2mLPBS緩沖液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1.0x10%/mL，吸取約10μL細(xì)胞懸液置于載玻片中，Wright-Giemsa染色1次，顯微鏡下觀察PBMC懸液是否制備成功。（3）流式染色：直接向成功制備的PBMC懸液中加入0.5pL的NF-kB抗體（NF-kBp65McAb，美國(guó)SantaCruz公司），室溫靜置1h后加入40μLFTTC標(biāo)記的IgG（1：100稀釋），室溫下靜置30min，再加入20μLPI染料，暗室內(nèi)靜置5min。（4）流式檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BectonEDickinson公司，F(xiàn)ACS400型）檢測(cè)NF-kB活性。

1.2.2觀察指標(biāo)：所有患者在入院時(shí)、入院后24h和出院時(shí)進(jìn)行NIHSS評(píng)分，并在發(fā)病后90d通過(guò)改良Rankin量表（mRS）評(píng)估AIS患者的神經(jīng)功能情況。以90d時(shí)的mRS評(píng)分為主要觀察指標(biāo)，其中mRS評(píng)分≤2分為神經(jīng)功能恢復(fù)良好，而mRS為3～6分認(rèn)為神經(jīng)功能預(yù)后不良。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS23.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用卡方（x2）檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線（receiveroperat-ingcharacteristic，ROC）和曲線下面積（AUC）分析NF-kB活性對(duì)AIS神經(jīng)功能不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值及預(yù)測(cè)閾值;通過(guò)單因素及多因素Logistic回歸分析確定影響AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1AIS患者的PBMC中NF-kB活性：AIS患者的PBMC中平均NF-kB活性為（28.32+8.70）%，而對(duì)照組的平均NF-kB活性為（13.19±4.51）%，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.25，P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.2AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后分組比較：根據(jù)90d時(shí)mRS評(píng)分將74例患者分為預(yù)后良好組（57例）和預(yù)后不良組（17例）。與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組患者的年齡更高、合并心房顫動(dòng)更多、入院時(shí)NIHSS評(píng)分更高，NF-kB活性顯著更高差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3NF-xB活性對(duì)神經(jīng)功能預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值分析：PBMC中NF-xB活性對(duì)神經(jīng)功能預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值A(chǔ)UC=0.87（P<0.01），閾值為28.20%，靈敏度為87.31%、特異度為72.12%。入院時(shí)NIHSS評(píng)分對(duì)神經(jīng)功能預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值A(chǔ)UC=0.76（P<0.01），閾值為14.00，靈敏度為69.41%、特異度為77.52%。見(jiàn)圖2。

2.4影響AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析：以年齡、心房顫動(dòng)、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、NF-kB活性為自變量，神經(jīng)功能預(yù)后不良為因變量進(jìn)行多因素Logistics回歸分析。結(jié)果顯示NF-kB活性>28.20%和入院時(shí)NIHSS評(píng)分>14分是影響AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

3討論

AIS是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點(diǎn)，是人類疾病的三大死亡原因之一[5]。AIS的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為腦血流阻斷導(dǎo)致的腦組織缺血、缺氧損害，隨后誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡是其主要的病理生理機(jī)制[6]。但近年來(lái)隨著相關(guān)研究的深人，逐漸發(fā)現(xiàn)腦缺血后導(dǎo)致的炎癥瀑布反應(yīng)在腦損傷中的重要地位。已有研究證實(shí)，腦缺血后存在明顯的炎癥細(xì)胞聚集增加、促炎因子表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞間粘附分子表達(dá)增加等炎癥反應(yīng)，提示炎癥反應(yīng)是腦組織缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[7]。

NF-kB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，由p50和p60兩個(gè)蛋白亞基組成。NF-kB是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其生物學(xué)功能是調(diào)控基因、特別是免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。一般情況下，NF-xB與抑制因子IkB結(jié)合，以非活性形式存在于胞漿中，當(dāng)在外界信號(hào)作用下，IkB發(fā)生磷酸化進(jìn)而降解，與NF-kB解離并移人核內(nèi)，激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用，從而參與機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，AIS患者PBMC中NF-kB的活性明顯升高，表明AIS患者體內(nèi)存在NF-kB的表達(dá)和激活異常，這種異?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)控許多基因特別是免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而參與機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)，參與了AIS發(fā)展。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能預(yù)后不良的AIS患者的NF-kB活性顯著高于神經(jīng)功能預(yù)后良好的AIS患者，表明NF-kB在AIS的疾病進(jìn)展中起到一定的作用。進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線發(fā)現(xiàn)PBMC中NF-kB活性超過(guò)28.20%是預(yù)測(cè)AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后不良的最佳閾值，靈敏度達(dá)87.31%、特異度達(dá)72.12%。并且通過(guò)多因素Logistics回歸分析證實(shí)了PBMC中NF-kB活性超過(guò)28.20%是影響AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示PBMC中NF-kB活性能夠有效評(píng)估AIS患者的神經(jīng)功能改善及預(yù)后情況。

由于NF-kB的活化炎癥反應(yīng)是復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)AIS患者的外周血PBMC中NF-kB活性顯著高于健康人群，同時(shí)NF-kB升高預(yù)示了AIS患者的神經(jīng)功能預(yù)后不良。因此遏制NF-kB的活化，從而減少多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，為AIS患者的治療和預(yù)后管理提供了新的思路，為臨床防治并發(fā)癥提供新的證據(jù)。

綜上所述，本文證實(shí)AIS患者處于NF-kB活化的狀態(tài)，并且NF-kB活性是影響AIS患者神經(jīng)功能預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為臨床診斷和隨訪AIS及其神經(jīng)功能預(yù)后情況提供了新的檢測(cè)指標(biāo)。但由于本研究?jī)H為單中心小樣本的，因此仍需要進(jìn)一步通過(guò)多中心、大樣本的前瞻性研究證實(shí)本研究結(jié)論。

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（收稿日期：2019-3-26）