自噬在骨穩(wěn)態(tài)與骨質(zhì)疏松癥中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

張欣然 林開利，2

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）是以骨量減少、骨脆性及骨折傾向增加為特征的漸進(jìn)性、系統(tǒng)性骨代謝疾病，隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率逐年增高。OP的一個(gè)重要臨床特征為病人早期的癥狀和體征缺乏或不明顯，這通常會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折（osteoporotic fracture,OF）、骨折后病人活動(dòng)受限及其他復(fù)雜并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病患的日常起居、自理能力，使個(gè)人與家庭蒙受生理和心理的雙重重?fù)?dān)?；A(chǔ)研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）、成骨細(xì)胞（osteoblasts,OB）及破骨細(xì)胞（osteoclasts,OC）等共同參與了OP的發(fā)生發(fā)展。自噬是真核細(xì)胞的高度保守行為，其與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激、損傷修復(fù)和增殖、分化等密切相關(guān)。近年來研究表明自噬在骨代謝以及BMSCs、OB、OC等的增殖、分化、代謝與生理功能行使中有重要的調(diào)控作用，但其具體機(jī)制尚未明確。因此，我們擬通過文獻(xiàn)綜述，并從自噬在間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）中的作用，自噬在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中的作用，自噬在破骨細(xì)胞中的作用等幾個(gè)方面去探索自噬與骨代謝的關(guān)系及其在OP發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、文獻(xiàn)檢索策略

本文通過中文檢索詞“自噬”、“骨質(zhì)疏松”、“間充質(zhì)干細(xì)胞”、“成骨細(xì)胞”、“破骨細(xì)胞”以及英文檢索詞“autophagy”、“osteoporosis”、“mesenchymal stem cells”、“osteoblast”、“osteo?clast”在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫、PubMed、Web of Science等平臺(tái)進(jìn)行檢索，篩選發(fā)表時(shí)間為近十年內(nèi)，共檢索到文獻(xiàn)723篇。應(yīng)用EndNote刪除重復(fù)及無法獲得全文文獻(xiàn)115篇，最終納入文獻(xiàn)36篇，其中中文文獻(xiàn)為3篇，英文文獻(xiàn)為33篇（圖1）。文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)為：①已正式發(fā)表的期刊文獻(xiàn)；②文獻(xiàn)內(nèi)容與自噬、骨質(zhì)疏松、骨穩(wěn)態(tài)維持的相關(guān)細(xì)胞密切相關(guān)；③同類研究中質(zhì)量、證據(jù)等級(jí)較高的文獻(xiàn)；④語言為中文及英文的文獻(xiàn)。文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)為：①文獻(xiàn)質(zhì)量、證據(jù)等級(jí)較低的文獻(xiàn)；②學(xué)位論文、會(huì)議類文獻(xiàn)；③非中文及英文的文獻(xiàn)；④無法獲得全文的文獻(xiàn)。

二、細(xì)胞自噬概述

自噬由Ashford等［1］于1962年通過電鏡首次發(fā)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞面臨外界環(huán)境壓力（如營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、缺氧等）或者在病理狀態(tài)下，細(xì)胞通過特殊包膜結(jié)構(gòu)（例如單層膜或者雙層膜）包裹長壽蛋白、有害物質(zhì)或受損的細(xì)胞器等形成自噬體，隨后通過溶酶體依賴途徑進(jìn)行分解代謝，而降解的產(chǎn)物用以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)成分的循環(huán)再利用［2］。目前，根據(jù)相關(guān)物質(zhì)從胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w過程中功能和途徑的不同，將自噬分為了以下幾類：巨自噬，小自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬。其中，巨自噬是自噬的主要類型，也是目前研究最多的一種類型，本文以下的自噬指巨自噬［3］。

通過基因篩選的相關(guān)研究，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了30多種自噬相關(guān)基因（autophagy?related gene,ATG），在自噬體的形成、調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用［4］。這些基因編碼的自噬相關(guān)蛋白在自噬早期募集到起始位點(diǎn)從而組成自噬的重要結(jié)構(gòu)——雙層隔離膜，隨后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器被隔離膜包裹，在這一過程中，Ⅲ類磷酸肌苷3激酶(classⅢphosphoinositide 3?kinase,classⅢ PI3K)/空泡分揀蛋白（vacu?olar protein sorting,Vps34）復(fù)合體被激活，然后與Beclin?1、ATG14、Vps15等蛋白一起形成多蛋白復(fù)合體，使雙層膜結(jié)構(gòu)不斷延伸，并進(jìn)一步招募ATG蛋白［5］。

ATG5、ATG7、ATG10和ATG12在擴(kuò)展、延伸雙層膜結(jié)構(gòu)以形成完整的自噬體的過程中起重要作用。首先，ATG5和ATG12在ATG7和ATG10的介導(dǎo)下形成ATG5?ATG12復(fù)合體，隨后結(jié)合ATG16L1，生成 ATG5?ATG12?ATG16L1 復(fù)合體［6］。微管相關(guān)蛋白輕鏈?3（microtubule?associated protein 1 light chain 3,LC3）前體首先由半胱氨酸蛋白酶ATG4切割，形成LC3?Ⅰ，然后通過ATG7、ATG10和ATG5?ATG12?ATG16L1復(fù)合體介導(dǎo)，LC3?Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanol?amine,PE）結(jié)合，生成LC3?Ⅱ［7］。LC3?Ⅱ是檢測(cè)自噬形成的可靠蛋白質(zhì)標(biāo)記物，包括了合成過程中的3種重要的形式：未處理形式（the unprocessed form,pro?LC3）、蛋白水解形式（the proteolytically,LC3?Ⅰ）和PE-共軛形式（the PE?conjugat?ed form,LC3?Ⅱ）。最后，在自噬溶酶體形成后，自噬體膜以及包封在自噬體中的物質(zhì)等被溶酶體內(nèi)的蛋白酶降解，并釋放至胞漿中以重新利用［8］（圖2）。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

雙層膜介導(dǎo)的胞內(nèi)溶酶體降解這一過程并不復(fù)雜，自噬作為細(xì)胞內(nèi)的“管家”，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性和確保細(xì)胞正常生理功能方面扮演著不可或缺的角色［9］。然而，在某些病理因素或者疾病發(fā)生過程中，自噬的功能可能會(huì)發(fā)生改變或者被異常激活，甚至發(fā)生自噬過度的情況而引起細(xì)胞凋亡或者死亡。生理情況下，細(xì)胞自噬可以將受損或者衰老的細(xì)胞器清除、更新來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，或者應(yīng)激狀態(tài)（如藥物作用、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等）下，細(xì)胞內(nèi)自噬水平會(huì)升高，各種刺激引起的細(xì)胞器損傷及時(shí)被消除，細(xì)胞的正常新陳代謝和多種生理功能得以維持［10］。然而，自噬的這種代償作用有一定限度，如果外界的刺激或者應(yīng)激狀態(tài)不能及時(shí)改善或者去除，一旦自噬的消耗超過了細(xì)胞的耐受閾值，可能導(dǎo)致一種不同于凋亡的程序性細(xì)胞死亡（Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡），乃至誘發(fā)一些疾病［11］。

三、自噬在骨穩(wěn)態(tài)中的調(diào)節(jié)作用

圖2 自噬的發(fā)生過程（繪圖作者：張欣然）

骨骼能夠?yàn)檐|體提供支撐和保護(hù)作用，但是骨功能作用的發(fā)揮需要骨形態(tài)、骨量以及骨質(zhì)等的長期穩(wěn)定。骨骼處于骨形成以及骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡（即骨穩(wěn)態(tài)）中，維持骨骼穩(wěn)態(tài)需要多種類型細(xì)胞（OB、OC、骨細(xì)胞等）、激素、因子等密切配合。其中，OB是主要發(fā)揮合成骨基質(zhì)作用的細(xì)胞，其由MSCs分化而來；OC是具有骨吸收作用的高度分化的多核巨細(xì)胞，源自造血干細(xì)胞；骨細(xì)胞是構(gòu)成骨質(zhì)的重要細(xì)胞，骨細(xì)胞能夠通過感知應(yīng)力和激素水平等的變化來調(diào)節(jié)OB及OC，其包封在礦化的骨基質(zhì)中、由OB終末期分化而來（圖3）。越來越多的研究表明：自噬與骨穩(wěn)態(tài)具有相關(guān)性，參與調(diào)控MSCs、成骨、破骨以及骨細(xì)胞［5］。

（一）自噬在MSCs中的作用

MSCs具有自我更新和多潛能分化能力，可以增殖、分化成多種類型細(xì)胞，例如OB、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞，BMSCs是一種存在于骨髓中的MSCs。骨組織發(fā)育、骨代謝、骨改建、骨修復(fù)和再生過程中所需要的成骨前體細(xì)胞，主要來源于 BMSCs［12］。2014年，Song等［13］研究表明H2O2介導(dǎo)的BMSCs的氧化應(yīng)激能夠造成細(xì)胞的大量死亡，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)自噬水平的提高可以促進(jìn)BMSCs的成活。Nuschke等［14］觀察到在未分化的BMSCs中有大量未降解的自噬空泡聚集或自噬體聚集；同時(shí)在BMSCs早期成骨分化過程中，BMSCs的胞體內(nèi)也有大量自噬體聚集，這說明自噬體可以作為能量快速產(chǎn)生的來源。自噬還參與維持來源于臍帶血的MSCs干性［15］。Pantovix等［16］研究表明單磷酸腺苷激活蛋白激酶（Ad?enosine 5′?monophosphate?activated protein kinase,AMPK）通路通過早期抑制哺乳動(dòng)物類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）和晚期激活蛋白激酶B（protein ki?nase B,AKT）/mTOR調(diào)節(jié)自噬，從而調(diào)控MSCs成骨分化。Liu等［17］通過應(yīng)用自噬抑制劑［如3-甲基腺嘌呤（3?methylade?nine,3?MA）等］進(jìn)一步研究了自噬在BMSCs中的作用：通過在BMSCs的培養(yǎng)過程中加入自噬抑制劑3-MA及氯喹，可見抑制劑組堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）陽性細(xì)胞數(shù)量及大小均下降；在加入抑制劑21 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示細(xì)胞礦化能力也下降。這些結(jié)果說明自噬抑制劑會(huì)影響B(tài)M?SCs的成骨分化及礦化能力。關(guān)于人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hu?man dental pulp mesenchymal stem cells,hDP?MSC）的研究結(jié)果也印證了這個(gè)結(jié)論：自噬抑制劑巴弗洛霉素A1（bafilomy?cin A1,BA1）、氯喹以及氯化銨可以抑制hDP?MSC的分化［16］。

（二）自噬在OB和骨細(xì)胞中的作用

OB由MSCs分化而來，是特殊化的MSC細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨形成。在骨形成過程中，一些OB陷于骨基質(zhì)中分化為骨細(xì)胞，而基礎(chǔ)研究證實(shí)自噬可以促進(jìn)OB的增殖、分化。Ozeki等［18］的研究表明ATG7和wingless/int1（Wnt）通路參與了骨形態(tài)生成蛋白-2（bone morphogenetic Protein?2,BMP?2）誘導(dǎo)的OB早期生成過程，BMP?2促進(jìn)了ATG7的表達(dá)，但對(duì)LC3、Be?clin1和ATG5等無作用。通過小干擾RNA沉默ATG7和Wnt16后，顯著抑制了BMP?2介導(dǎo)的人骨骼肌干細(xì)胞（hu?man skeletal muscle stem cell,hSMSC）向成骨細(xì)胞分化；而自噬激動(dòng)劑雷帕霉素（rapamycin）提高了hSMSC的成骨分化，這說明自噬參與促進(jìn)早期成骨細(xì)胞分化。這與Nollet等［19］關(guān)于OB在骨穩(wěn)態(tài)和骨骼礦化過程中的研究結(jié)果一致：大鼠成骨細(xì)胞系的礦化能力隨自噬相關(guān)基因ATG7和Beclin?1被siRNA技術(shù)沉默而顯著下降。此外，Jung等［20］和Zhu等［21］的研究還表明增強(qiáng)自噬可以減輕細(xì)胞氧化損傷并抑制細(xì)胞凋亡：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NO和H2O2等會(huì)引起OB的凋亡及功能異常，而通過AMPK通路活化自噬可以減輕相應(yīng)的損傷。進(jìn)一步，王雅雯等［22］通過CoCl2制備人hFOB1.19成骨細(xì)胞系的缺氧模型，結(jié)果顯示缺氧環(huán)境可激活細(xì)胞自噬，并且OB的自噬水平與缺氧作用時(shí)間呈正相關(guān)，成骨細(xì)胞自噬活性的不斷增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

與此同時(shí)，也有部分研究表明自噬對(duì)OB起到負(fù)調(diào)控作用。Chen等［23］的研究中，在顱骨來源的OB中敲除Raptor（mTORC1的一個(gè)重要組成部分）以降低OB相應(yīng)的mTORC1功能，提高細(xì)胞自噬水平，導(dǎo)致OB的基質(zhì)合成與礦化能力均下降；相應(yīng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Raptor敲除小鼠骨質(zhì)減少。Yeong等［24］研究表明，在微重力引發(fā)的骨量喪失或者骨質(zhì)疏松中，應(yīng)用褪黑素可以降低MC3T3?E1中的自噬水平、抑制細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化損傷，從而提高細(xì)胞的存活率，其機(jī)制與磷酸化ERK/Akt/mTOR通路相關(guān)。

（三）自噬在OC中的作用

圖3 各種細(xì)胞在骨穩(wěn)態(tài)維持中的作用（繪圖作者：張欣然）

OC是一種來源于骨髓的高度分化的多核巨細(xì)胞，OC不僅參與骨質(zhì)的吸收，還是一種重要的免疫細(xì)胞。OC與OB的成骨作用相互協(xié)調(diào)配合，相輔相成，同時(shí)也參與免疫應(yīng)答過程［25］。研究表明OC的形態(tài)可能與自噬密切相關(guān)，例如ATG5、ATG7、ATG4B、LC3等自噬相關(guān)基因的缺陷會(huì)引起OC形態(tài)變化、功能障礙［26］。Lin等［27］也發(fā)現(xiàn)在卵巢切除術(shù)或應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的小鼠中，采取自噬抑制劑氯喹或抑制單核細(xì)胞ATG7可以抑制破骨相關(guān)基因的表達(dá)和OC的分化，從而緩解模型所誘發(fā)的骨質(zhì)流失，印證了細(xì)胞自噬可能具有促進(jìn)OC分化的作用。然而也有一部分研究得出相反的結(jié)論，指出細(xì)胞自噬可能抑制OC分化，例如在體外實(shí)驗(yàn)中使用自噬激活劑Rapamycin可以減少OC的形成，從而減少骨質(zhì)流失［28］。

四、自噬與骨質(zhì)疏松

在正常生理情況下，破骨-成骨的動(dòng)態(tài)平衡使骨代謝保持正常狀態(tài)，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，就可能導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)的異常，最終發(fā)生OP。對(duì)于老年或絕經(jīng)后婦女OP病人，往往并發(fā)OF等多種并發(fā)癥［29］。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常個(gè)體相比，體外培養(yǎng)OP來源的BMSCs，可見OP來源的BMSCs向成骨細(xì)胞分化的數(shù)目減少，更傾向于向脂肪細(xì)胞分化［30］。對(duì)OP病人外周血檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常人相比，OP病人ALP、mTOR以及Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt?related transcription factor 2,Runx?2）的表達(dá)量均降低，相關(guān)性分析結(jié)果顯示Runx?2與mTOR的表達(dá)呈正相關(guān)，并且骨密度與Runx?2的表達(dá)也存在正相關(guān)，提示OP病人骨密度的下降可能與自噬相關(guān)基因mTOR存在著一定關(guān)聯(lián)性［31］。

關(guān)于細(xì)胞自噬和OP的相關(guān)性研究，目前已經(jīng)在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中廣泛開展。研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠的骨細(xì)胞自噬關(guān)鍵因子LC3?Ⅱ和Beclin?1表達(dá)降低、細(xì)胞自噬水平降低，而sequestosome?1（p62/SQSTM1）和骨細(xì)胞凋亡水平升高［32］。由于OP表現(xiàn)出一定的年齡相關(guān)性，因此我們推測(cè)不僅自噬與OP可能存在相互調(diào)控的關(guān)系，年齡因素、自噬與OP三者的相互關(guān)系同樣不容忽視。除了年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥，自噬在遺傳性骨質(zhì)疏松癥中同樣有著重要的作用。常染色體隱形遺傳性骨質(zhì)疏松癥（autosomal recessive osteopetrosis,ARO）是一種惡性的先天性骨質(zhì)疏松癥，研究表明在ARO模型小鼠中，調(diào)控細(xì)胞自噬早期階段的V?ATP酶的編碼基因發(fā)生突變，導(dǎo)致p62表達(dá)降低、LC3?Ⅱ水平升高，使自噬水平異常，從而影響了OC的發(fā)育成熟［33］。此外，OP也與雌激素水平密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠卵巢切除模型中，雌激素水平的降低提高了自噬活性，小鼠脛骨近端骨礦物質(zhì)密度下降；然而雌激素的應(yīng)用能夠促進(jìn)自噬水平恢復(fù)正常，并抑制了骨的流失［34］。但是通過建立雙側(cè)卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松模型，F(xiàn)lor?enci等［35］提出了相反的觀點(diǎn)：雌激素缺乏可以導(dǎo)致自噬水平降低、細(xì)胞凋亡增多，而雌激素替代治療可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。綜上，近年來相關(guān)研究表明雌激素可以抑制骨細(xì)胞凋亡，自噬可能參與了這個(gè)過程，但是具體的正負(fù)調(diào)控作用仍不明確。此外，骨質(zhì)疏松大鼠接受藥物干預(yù)后，大鼠成骨標(biāo)志物BMP?2、Runx?2和自噬標(biāo)志物 Beclin?1、ATG5和LC3的表達(dá)均顯著增加，微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro computed tomog?raphy,micro?CT）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠脊椎骨的骨密度、骨量、骨小梁的數(shù)量及厚度均顯著增加，這表明骨質(zhì)疏松的改善與自噬水平的增加有關(guān)［36］（圖3）。

迄今，關(guān)于自噬與OP的關(guān)系的研究多聚焦于動(dòng)物模型與離體實(shí)驗(yàn)，臨床研究所提供的信息較少。Zhang等［37］的一項(xiàng)基于984位白人研究對(duì)象的人類基因研究表明，自噬通路調(diào)控基因是唯一與橈骨遠(yuǎn)端骨密度變化直接相關(guān)的基因，這為自噬在OP發(fā)生發(fā)展中的作用提供了直接的人體試驗(yàn)證據(jù)。

五、展望

細(xì)胞自噬在骨穩(wěn)態(tài)的維持中起著重要的作用，骨穩(wěn)態(tài)平衡的打破會(huì)導(dǎo)致OP的發(fā)生，然而自噬與骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控及OP的發(fā)生、發(fā)展究竟為正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)，是自噬在骨代謝領(lǐng)域中的研究焦點(diǎn)之一。一些研究提示提高細(xì)胞自噬水平可以促進(jìn)破骨作用和骨吸收，自噬與OP呈正相關(guān)，因而采取抑制細(xì)胞自噬可能成為治療或預(yù)防OP的新方法。然而，亦有一部分研究得出了相反的結(jié)論，指出自噬與OP呈負(fù)相關(guān)，對(duì)OP的發(fā)生發(fā)展有抑制作用，因此自噬水平的降低可能導(dǎo)致OP的發(fā)生。我們推測(cè)，過度或低下的自噬水平均可能不利于骨代謝和骨穩(wěn)態(tài)，調(diào)控自噬水平使之保持在適度范圍內(nèi)可能成為治療OP的新靶點(diǎn)，而這需要在進(jìn)一步研究中加以闡釋。此外，對(duì)于OP的全身性治療中，近年來基礎(chǔ)研究表明一些中藥及其主要成分在治療OP中具有一定的作用和價(jià)值，而自噬在中藥干預(yù)OP中的作用和機(jī)制尚不明確，因此明確自噬與中藥的關(guān)系能夠?yàn)镺P的治療提供新靶點(diǎn)，為發(fā)揮中醫(yī)藥的特色診療提供新方法；由于OP發(fā)病率高，影響人群較大，對(duì)于OP病人局部骨缺損的修復(fù)也值得進(jìn)一步研究，自噬是細(xì)胞成骨分化不可缺少的一個(gè)過程，骨缺損修復(fù)材料的改性是否會(huì)誘發(fā)成骨相關(guān)細(xì)胞自噬的改變從而來影響OP病人局部骨缺損修復(fù)的效果，也值得進(jìn)行深入研究從而為指導(dǎo)骨修復(fù)材料的改性提供理論支持。

綜上所述，通過深入研究細(xì)胞自噬在OP中的作用及機(jī)制，并通過調(diào)控自噬促進(jìn)骨代謝的穩(wěn)態(tài)平衡，可以為全身性延緩或控制OP的發(fā)生與發(fā)展以及局部促進(jìn)OP病人骨缺損的修復(fù)提供新的思路。