Alcalase蛋白酶對(duì)草魚魚鱗膠原多肽提取的研究

趙莎

（西安培華學(xué)院，陜西西安 710125）

膠原蛋白廣泛存在于各種生物體，因其生物相容性和低抗原性而廣泛應(yīng)用于食品、保健食品等多個(gè)領(lǐng)域[1]。魚鱗的相對(duì)分子質(zhì)量大且分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其水解物膠原多肽相對(duì)分子質(zhì)量低、滲透性好、親水性強(qiáng)而應(yīng)用廣泛。我國(guó)是當(dāng)今世界淡水養(yǎng)殖業(yè)最為發(fā)達(dá)的國(guó)家之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年淡水魚加工業(yè)的廢棄物中魚鱗約為30萬(wàn)噸[2]。有關(guān)研究表明，魚鱗的主要成分為膠原蛋白，占魚鱗總質(zhì)量的50%～70%[3]。草魚作為四大家魚之一，其水產(chǎn)品加工產(chǎn)生大量魚鱗、魚骨等廢棄物[4]，為了充分利用這些廢棄物，本研究以草魚魚鱗為原料，對(duì)Alcalase蛋白酶制備魚鱗膠原多肽的水解工藝進(jìn)行初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

草魚魚鱗，購(gòu)于西安培華學(xué)院門口菜市場(chǎng)；Alcalase堿性蛋白酶（2.4 AU/g），意諾聯(lián)創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱儀器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；GL-20G-Ⅱ高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 脫鈣魚鱗的制備

將草魚魚鱗取純凈水清洗干凈，用紗布吸干表面水分，去除魚皮和魚肉，加入15倍體積的0.4 mol/L鹽酸，室溫反應(yīng)3 h后，再用純凈水清洗，再放置鼓風(fēng)干燥箱烘干，脫鈣魚鱗制備完成。

2.2 Alcalase蛋白酶對(duì)草魚魚鱗提取草魚魚鱗膠原多肽粉

將烘干的草魚脫鈣魚鱗進(jìn)行預(yù)處理，Alcalase蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解再進(jìn)行滅酶，酶解結(jié)束后用0.3%活性炭進(jìn)行去腥、脫色，再進(jìn)行高速離心后取上清液進(jìn)行冷凍干燥，干燥后即為所得到的膠原多肽粉。

2.3 預(yù)處理溫度對(duì)膠原多肽提取的影響

稱取10 g處理過(guò)的脫鈣魚鱗，加入100 mL ddH2O，分別于50 ℃、100 ℃及121 ℃加熱10 min，然后于加酶量為0.07 AU/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，在60 ℃條件下反應(yīng)3 h左右。

2.4 酶解膠原多肽最佳工藝的研究

2.4.1 加酶量對(duì)膠原多肽提取率的影響

用電子天平稱取10 g脫鈣魚鱗，加100 mL ddH2O，于121 ℃條件下預(yù)處理10 min，再分別加入濃度為0.02、0.04、0.06、0.08 AU/g和0.10 AU/g的Alcalase蛋白酶，在60 ℃條件下反應(yīng)3 h，徹底水解后進(jìn)行滅酶（100 ℃水浴10 min），酶解結(jié)束后0.3%活性炭進(jìn)行去腥、脫色，后于4 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL進(jìn)行酶解消化，再用凱氏定氮法測(cè)定多肽含量。

2.4.2 酶解時(shí)間對(duì)膠原多肽提取率的影響

取10 g脫鈣魚鱗混合于100 mL ddH2O中，于121 ℃預(yù)處理10 min，然后加入0.07 AU/g的Alcalase蛋白酶，于60℃反應(yīng)1、1.5、2、2.5、3、3.5 h及4 h，后續(xù)操作同2.4.1。

2.4.3 酶解溫度對(duì)膠原多肽提取率的影響

用電子天平稱取10 g處理好的脫鈣草魚魚鱗，加至 100 mL ddH2O中，于121 ℃預(yù)處理 10 min，然后加入0.07 AU/g的Alcalase蛋白酶，分別于40、45、50、55、60、65 ℃和70 ℃溫度下保溫3 h，后續(xù)操作同2.4.1。

2.4.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠原多肽提取率的影響

分別稱取 5、10、15、20 g及25 g處理好的脫鈣草魚魚鱗，分別加入100 mL ddH2O并充分混合，預(yù)處理?xiàng)l件為121 ℃、10 min，再加入Alcalase蛋白酶的量為0.07 AU/g，于60 ℃反應(yīng)3 h，后續(xù)操作同2.4.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 預(yù)處理溫度對(duì)酶解作用的影響

將10 g脫鈣鯉魚魚鱗與100 mL ddH2O蒸餾水混勻，分別于50 ℃、100 ℃和121 ℃條件加熱10 min，按照上述加酶量取適量Alcalase蛋白酶，底物濃度15%、60 ℃條件下反應(yīng)3 h，魚鱗膠原多肽提取率如圖1所示。由圖1得出，魚鱗膠原多肽提取率會(huì)隨著溫度的升高而顯著增加。造成這種原因可能是由于隨著壓力和溫度的升高，膠原蛋白多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)變性，有利于Alcalase蛋白酶對(duì)其水解作用。

圖1 預(yù)處理溫度對(duì)膠原多肽提取的影響

3.2 膠原多肽酶解工藝研究

3.2.1 加酶量對(duì)蛋白提取率的影響

從圖2可知，加酶量在0.02～0.07 AU/g時(shí)，增加加酶量使得蛋白的提取率顯著增長(zhǎng)，出現(xiàn)這種情況的原因可能是增加加酶量會(huì)使得酶與底物結(jié)合的概率加大，其水解程度明顯增強(qiáng)。當(dāng)加酶量達(dá)到0.07 AU/g時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最高，后再增加加酶量提取率降低，這可能由于加酶量達(dá)到一定程度將幾乎所有反應(yīng)底物徹底反應(yīng)掉[5]。反應(yīng)底物已耗盡，增加酶量無(wú)法使水解度得到顯著提高，因此選擇最佳加酶量為0.07 AU/g。

3.2.2 酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

由圖3可知，Alcalase堿性蛋白酶在催化反應(yīng)前期存在較高活性，在約3 h時(shí)魚鱗膠原蛋白進(jìn)行酶解提取率最高。隨著酶解時(shí)間的增加，膠原蛋白的提取率不變，可能是3 h以后膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較高導(dǎo)致提取液變黏稠，阻止了酶與底物接觸，再增加反應(yīng)時(shí)間也不會(huì)使得膠原蛋白含量顯著升高[6]。因此，選擇3 h為最佳時(shí)間。

圖2 Alcalase蛋白酶加酶量對(duì)膠原多肽提取率的影響

圖3 Alcalase蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)膠原多肽提取率的影響

3.2.3 酶解溫度對(duì)蛋白提取率的影響

實(shí)驗(yàn)得出酶解溫度在50～60 ℃時(shí)，酶解液中蛋白質(zhì)含量明顯升高，達(dá)到60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)到最高。隨著酶解溫度繼續(xù)升高，酶解速度逐漸下降，可能是在酶最適溫度以下，隨著溫度的升高反應(yīng)物的能量和分子間有效接觸的頻率增加。當(dāng)溫度過(guò)高酶分子吸收了過(guò)多能量，維持酶蛋白分子的次級(jí)鍵斷裂，使得Alcalase酶蛋白變性，酶活性由此降低甚至喪失。選擇60 ℃為最佳酶解溫度。

3.2.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白提取率的影響

實(shí)驗(yàn)得出在反應(yīng)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，提取率增長(zhǎng)越快，在15%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，Alcalase蛋白酶酶解達(dá)到最高。隨著反應(yīng)底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增高，膠原蛋白提取率幾乎不變。這可能是由于底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，引起水解反應(yīng)液黏度過(guò)高，從而影響蛋白酶與底物的接觸，酶解反應(yīng)速度降低并抑制水解反應(yīng)。因此，選擇15%為反應(yīng)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中選取樣本草魚魚鱗含有豐富的膠原蛋白量，作為制備水解膠原蛋白的良好原料。采用Alcalase蛋白酶水解草魚魚鱗膠原蛋白，具有水解反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。