微生物檢測中ATP生物發(fā)光法的應用研究現(xiàn)狀

易琳

（西華師范大學生命科學學院，四川南充 637000）

人類的身體健康、生命安全長期受到微生物污染的威脅，營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)法是國際上針對微生物檢測的現(xiàn)有標準方法，然而該方法要求在37 ℃下持續(xù)培養(yǎng)48 h，過于繁瑣的操作無法實現(xiàn)快速檢測?，F(xiàn)下，國內(nèi)也加大了對核酸法、電阻抗測量、免疫學方法、微菌落技術(shù)等各類微生物快速檢測技術(shù)展開了研究、應用。ATP生物發(fā)光法因快速、簡便且具有較高靈敏度的緣故，可用于實時監(jiān)控微生物污染，與食品行業(yè)需求相符合，故而有關(guān)該技術(shù)的研究與應用十分廣泛。

1 食品檢驗中現(xiàn)代生物技術(shù)應用的重要性

品質(zhì)較高的食品安全檢驗能為食品提供一定的安全性保障。我國近年來逐漸加大了有關(guān)食品安全問題的重視程度，在現(xiàn)代生物理論的運用下，促使現(xiàn)代生物技術(shù)獲得了更為廣泛的運用領(lǐng)域[1]。同時，近年來生物技術(shù)的快速發(fā)展，使其得以在實現(xiàn)精確測試檢驗的基礎(chǔ)上，也具備了安全、環(huán)保等特點，十分適用于食品安全檢驗。傳統(tǒng)生物及食品檢驗技術(shù)難以為食品提供可靠的安全性保障，這也進一步凸顯了現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展前景。鑒于此，本文深入探究了ATP生物發(fā)光法在微生物檢測中的運用。

2 ATP生物發(fā)光技術(shù)檢測微生物的原理及一般步驟

ATP生物發(fā)光技術(shù)是在Mg2+和熒光素酶E的作用下，ATP與熒光素LH2產(chǎn)生腺苷?；换罨鵁晒馑卦诒换罨蠼Y(jié)合熒光素酶會有熒光素—AMP復合體形成，且會有焦磷酸（PPi）產(chǎn)生。當分子氧將復合體氧化后，會有激發(fā)態(tài)復合物P*-AMP形成，并有CO2產(chǎn)生。而該復合物由激發(fā)態(tài)朝著基態(tài)轉(zhuǎn)化期間會有光射出，最終會有氧化沖熒光素P和AMP形成。具體反應過程如下：

就ATP生物發(fā)光技術(shù)而言，其檢測步驟通常為：首先對ATP生物發(fā)光值及樣品微生物含量標準曲線進行繪制，隨后在取樣、ATP提取、酶反應試劑添加、樣品微生物ATP發(fā)光值測定完成之后，以標準曲線為根據(jù)對樣品中微生物實際數(shù)值進行測定。

3 ATP生物發(fā)光法的優(yōu)缺點

ATP生物發(fā)光法主要包含簡便、快速及較好重現(xiàn)性等優(yōu)點。但是，因其對樣品提出了至少1 000個/mL細菌濃度的要求，故而無法將衛(wèi)生學提出的有關(guān)靈敏度的要求有效滿足。同時也有ATP生物發(fā)光法無法對微生物及非微生物的ATP進行區(qū)分等缺點[2]。ATP生物發(fā)光法優(yōu)缺點及應用范圍見表1、表2。

表1 ATP生物發(fā)光法優(yōu)缺點

表2 ATP生物發(fā)光法應用范圍

4 ATP生物發(fā)光技術(shù)在食品微生物檢測中的應用——以酸奶Fe3O4檢測為例

4.1 試驗方法

化學發(fā)光檢測：取出1.0μ mol的氨基改性Fe3O4納米粒子，采用吡啶緩沖液反復清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室溫環(huán)境下持續(xù)3h振蕩。加入ATP適體10 pmol，置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1 h。采用WB清洗液反復清洗后，在其內(nèi)加入2% BSA溶液200μL，置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1 h。再次采用WB清洗液反復清洗后，將Fe3O4納米粒子移入100 μL ATP中（濃度為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、6 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L），置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1 h[3]。再次采用WB清洗液反復清洗后磁性分離，借助超純水將Fe3O4納米粒子朝著一端開口的圓柱形玻璃瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移，并置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90 μL熒光素酶緩沖液，對其熒光發(fā)光強度進行測量，最終信號值以最高信號值出現(xiàn)后10 s的積分值為主。

借助化學發(fā)光法檢測ATP特異性并開展干擾性實驗：取出1.0 μmol的氨基改性Fe3O4納米粒子，采用吡啶緩沖液反復清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室溫環(huán)境下持續(xù)3h振蕩。加入10 pmol ATP適體在室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1h。采用WB清洗液反復清洗后，在其內(nèi)加入200μL 2% BSA溶液，置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1h。借助WB清洗液再次清洗后，在CTP溶液（100μL）、UTP溶液（100μL）、GTP溶液（100μL）、ATP和CTP混合液、ATP和GTP混合液、空白AA緩沖液中加入ATP溶液（10μmol/L），置于室溫環(huán)節(jié)下持續(xù)1h振蕩[4]。采用WB清洗液反復清洗后磁性分離。借助超純水將Fe3O4納米粒子朝著一端開口的圓柱形玻璃瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移，并置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90μL熒光素酶緩沖液，對其熒光強度進行測量。

4.2 結(jié)果

依據(jù)上述檢測結(jié)果完成曲線圖的繪制。根據(jù)圖1能發(fā)現(xiàn)，R2=0.996 3時，具有良好的線性范圍，在ATP定量檢測中十分適用。在CTP、GTP、UTP溶液中，表現(xiàn)出較低熒光強度；而在ATP、CTP、GTP、UTP混合溶液中，熒光強度所受到的影響并不大，實驗具有較高可行性。

圖1 化學發(fā)光檢測ATP工作曲線

在測定酸奶中ATP時，將乳酸菌中ATP提取后，以Fe3O4納米粒子作為實驗對象，依據(jù)化學發(fā)光法對其發(fā)光值檢測，依據(jù)特性完成ATP捕獲[5]。依據(jù)試驗結(jié)果得知，隨著乳酸菌含量的增加，化學發(fā)光值及ATP提取量也在上升，實驗存在較為突出的重復性。通過圖2了解到，每mL酸奶乳酸菌中含有3.98×10-8mol ATP量。故而，針對本試驗中的Fe3O4納米粒子而言，可在視頻分析檢測領(lǐng)域中作為載體使用。

圖2 不同溶液中ATP發(fā)光值的測定

5 結(jié)論

ATP發(fā)生發(fā)光法相對于其他微生物快速檢測方法而言，因簡單、快速便捷及較高靈敏度等優(yōu)點的緣故，優(yōu)勢十分突出，被廣泛運用于食品加工行業(yè)之中[6]。然而，由于外界因素極易對該方法造成干擾的緣故，對于微生物種類無法實現(xiàn)定性鑒別，在直接檢測個別樣品時也無法將要求的靈敏度實現(xiàn)[7]。故而，ATP提取劑的合理選擇、外界因素干擾的降低、微生物特異性識別的增強及檢測靈敏度的提高成為了該方法進一步改善及深入研究的重要方向。

ATP生物發(fā)光法具備103CFU/mL的檢測限，然而大部分致病菌卻呈現(xiàn)出10 CFU/mL的致病濃度。因免疫磁分離技術(shù)（IMS）可將濃縮、選擇性分離等作用發(fā)揮在樣品中，故而將ATP生物發(fā)光法與IMS技術(shù)結(jié)合后對細菌進行檢測，不但可將外界因素干擾降低，同時也能對微生物進行特異性識別，可實現(xiàn)檢測靈敏度的有效提升[8]。同時，針對熒光毛細分析法而言，在發(fā)光檢測儀中引入毛細管可實現(xiàn)小型化。在不斷發(fā)展的科技技術(shù)下，ATP生物發(fā)光法必然能夠更為成熟、完善，其應用領(lǐng)域、范圍也必然會不斷擴大。