CRISPR/Cas9技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用

周芮，張辟

（華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430074）

近些年，CRISPR/Cas技術(shù)的出現(xiàn)為整個生物領(lǐng)域帶來了革命性的變化。研究者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以快速、準確的實現(xiàn)生物體基因組編輯和動物模型構(gòu)建。同時，研究人員在CRISPR/Cas9基礎(chǔ)上進行多種改造，將其擴展應(yīng)用于基因表達調(diào)控，表觀遺傳修飾，高通量遺傳篩選，基因治療等方面?；蚬δ苎芯渴钱?dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的重大課題之一，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于基因功能研究領(lǐng)域，取得了眾多成果，極大地推動了該研究領(lǐng)域發(fā)展，對于揭示基因的生物學(xué)功能以及疾病治療具有重大意義。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)分類及作用機制

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌為抵御外源DNA入侵進化形成的獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas基因簇由Cas蛋白的編碼基因和CRISPR基因序列組成。根據(jù)Cas基因組成，效應(yīng)蛋白復(fù)合物不同以及CRISPR自身結(jié)構(gòu)的不同等多個標(biāo)準，CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要分為兩大類，一類是形成多效應(yīng)蛋白復(fù)合物的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；另一類是形成單一效應(yīng)蛋白的CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型，其中Ⅵ型為新發(fā)現(xiàn)的靶向特異性RNA序列的CRISPR/Cas系統(tǒng)[1]。

做為細菌和古細菌的免疫系統(tǒng)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫過程大致分為3個階段。（1）適應(yīng)階段。首次入侵的外源DNA的原間隔序列（Protospacer）被宿主菌中的Cas蛋白獲取，并作為間隔序列（Spacer）插入到兩段重復(fù)序列之間。（2）表達階段。當(dāng)外源DNA再次入侵時，CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄生成一段初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物前體RNA（pre-crRNA），再由核糖核酸酶或Cas蛋白加工形成成熟的crRNA。（3）干擾階段。Cas蛋白與成熟的crRNA形成的復(fù)合體特異性識別切割外源DNA序列，造成DNA雙鏈斷裂[2]。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)不僅需要Cas9蛋白與crRNA（CRISPR RNA），還需要反式激活crRNA（Trans-activting crRNA，tracrRNA）參與CRISPR所調(diào)控的免疫過程。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，tracrRNA會與CRISPR序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA形成復(fù)合物，該復(fù)合物與Cas9蛋白結(jié)合，經(jīng)內(nèi)源RNase Ⅲ和其他RNase酶加工生成成熟的tracrRNA-crRNA-Cas9蛋白復(fù)合體。隨后Cas9蛋白識別目的DNA的PAM位點（Protospacer adjacent motif)，crRNA與DNA進行堿基互補配對，識別配對成功后Cas9蛋白的兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH和RucV分別切割DNA兩條單鏈，造成DNA雙鏈斷裂。之后研究者根據(jù)crRNA-tracrRNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)將其改造為sgRNA（single-guide RNA），同樣可以結(jié)合Cas9特異性識別切割靶位點[3]。因此，研究者只需根據(jù)目的基因序列設(shè)計相對應(yīng)的sgRNA即可利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在含有PAM元件的靶位點造成DNA雙鏈斷裂，進而誘導(dǎo)DNA通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）方式進行修復(fù)，隨機引入多個堿基的缺失或插入，或者通過同源重組（Homology-directed repair，HDR）方式進行自我修復(fù)，實現(xiàn)準確的基因敲入，達到基因編輯的目的（圖1）。研究者同時轉(zhuǎn)入多個sgRNAs即可實現(xiàn)對多個靶基因進行編輯，基于此特點，研究人員建立sgRNAs文庫導(dǎo)入細胞即可實現(xiàn)對基因組進行大規(guī)模定點編輯，進而CRISPR/Cas9系統(tǒng)被開發(fā)為高通量遺傳篩選工具。dCas9是將Cas9兩個具有切割活性的結(jié)構(gòu)域RuvC、HNH同時突變失活，使其不具備核酸酶活性。dCas9雖然無法切割DNA雙鏈，但仍可以協(xié)同sgRNA特異性識別結(jié)合DNA靶序列，基于此特點，研究人員將dCas9蛋白與轉(zhuǎn)錄抑制子或轉(zhuǎn)錄激活子融合，就可以調(diào)控靶基因表達。與此同時，研究人員將dCas9與真核生物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，DNA去甲基化酶或組蛋白修飾酶融合，即可進行表觀基因組編輯[4]。

圖1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)原理

3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因功能研究領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 利用CRISPR基因編輯技術(shù)進行基因功能研究

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)使得生物體基因編輯變得更加簡單和高效。目前，研究人員已經(jīng)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在多種細胞系和生物體中實現(xiàn)基因編輯，通過建立特定基因敲除或敲入的細胞系和動物模型，可以快速準確揭示生理及病理相關(guān)基因的具體功能，為疾病治療提供理論基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9技術(shù)可以幫助科研人員研究生物體生理活動相關(guān)基因的具體功能，揭示人體生理機制。Jang等[5]為研究AMPK基因在自噬小體成熟及其與溶酶體融合過程中所扮演的角色，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建AMPKα1基因敲除的HEK293T細胞系，最終實驗結(jié)果表明AMPK對于自噬小體的成熟及其與溶酶體融合非常重要。Lloyd等[6]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CG7466基因無效突變果蠅，研究基因功能喪失后的相關(guān)表型，發(fā)現(xiàn)CG7466基因?qū)τ诠壴缙诎l(fā)育是必需的。豬在解剖學(xué)和生理學(xué)方面與人類極為相似，是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域理想的動物模型。Sheets等[7]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)得到了NGN3基因敲除的小豬，證實NGN3基因?qū)τ谪i內(nèi)分泌腺發(fā)育是必需的，此類研究為在豬體內(nèi)培育人體器官提供了寶貴的資源。2018年中科院等科研團隊利用CRISPR技術(shù)建立了世界首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型，SIRT6基因在嚙齒動物中被認為是長壽基因，但在靈長類動物中的生物學(xué)功能還未知。研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，采用一步法構(gòu)建SIRT6基因在靈長類動物食蟹猴中全身敲除的模型，發(fā)現(xiàn)SIRT6基因敲除導(dǎo)致食蟹猴在子宮內(nèi)出現(xiàn)嚴重的全身發(fā)育遲緩，并在出生數(shù)小時內(nèi)死亡，該研究結(jié)果表明SIRT6基因參與調(diào)控非人類靈長類動物發(fā)育，且該成果為人類圍產(chǎn)期致死綜合癥研究提供可能機制，也為開展人類發(fā)育和衰老相關(guān)疾病研究奠定了基礎(chǔ)[8]。

CRISPR基因編輯技術(shù)也可用于研究疾病相關(guān)基因，幫助研究人員了解疾病分子機制為疾病治療提供新的途徑。Schleicher等[9]為探究PARP10基因在細胞癌變以及癌細胞增殖中的作用，利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了PARP10基因敲除的Hela細胞系，發(fā)現(xiàn)PARP10基因敲除抑制了癌細胞的增殖，且在該細胞系重新表達PARP10可以消除其對癌細胞增殖的影響，研究最終表明PARP10可能通過緩解復(fù)制壓力而促進細胞增殖以及細胞癌變，由此PARP10有望成為癌癥治療中新的靶點。遺傳性視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP)是一種神經(jīng)退行性疾病，在5%～10%RP病例中檢測到EYS基因突變，但EYS基因功能以及EYS突變導(dǎo)致RP疾病發(fā)生的分子機制仍舊不清楚。Messchaert等[10]以斑馬魚為模型，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建EYS基因敲除型斑馬魚，結(jié)果顯示，在斑馬魚中EYS基因缺失會導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)混亂，引起視覺功能障礙，該EYS基因缺失斑馬魚模型以后也可用于研究EYS突變導(dǎo)致RP疾病發(fā)生的機制。2018年，F(xiàn)eng[11]將CRISPR/Cas9技術(shù)與體細胞克隆技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了ApoE基因敲除體細胞克隆狗模型，為動脈粥樣硬化疾病的研究提供更有效的大動物模型，同時這也是世界首例基因敲除體細胞克隆犬的誕生。同年，Zhu等[12]結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)和體細胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入迷你豬，該研究為研發(fā)治療亨廷頓舞蹈癥新藥提供了穩(wěn)定可靠的動物模型。

3.2 利用CRISPR高通量篩選技術(shù)進行基因功能研究

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的高通量篩選技術(shù)更加簡單和準確，該方法可以讓研究者快速找到與某一特定表型相關(guān)的基因，揭示人類基因組功能，服務(wù)于人類疾病研究及治療。

CRISPR高通量篩選技術(shù)可用于鑒定病毒感染相關(guān)宿主基因，為病毒感染疾病治療提供新的靶標(biāo)。2018年，Zhang等[13]利用張鋒實驗室建立的靶向小鼠全部基因組的GeCKOv2文庫，以3T3細胞株為模型，篩選出Mrax8受體蛋白是基孔肯雅病毒入侵宿主細胞所必需的宿主受體蛋白，且其他致關(guān)節(jié)炎甲病毒也需要Mrax8受體蛋白侵入宿主，缺少Mrax8可以減少病毒感染程度，該項研究為多種致關(guān)節(jié)炎類甲病毒感染治療提供了有效的靶標(biāo)。除了進行功能喪失型篩選，研究者也可利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行功能獲得型篩選，用于鑒定宿主細胞內(nèi)具有抗病毒作用的基因，Heaton等[14]建立了針對基因啟動子的sgRNA文庫，利用CRISPR協(xié)同激活因子系統(tǒng)（CRISPR synergistic activation mediator，CRISPRSAM）對A549細胞株進行基因過表達篩選，發(fā)現(xiàn)B4GALNT2基因過表達可以阻斷全部禽流感病毒亞型感染，這項研究為抗流感感染藥物研發(fā)提供了新的靶點，也為以后篩選新的宿主因子提供參考。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)可以研究參與癌癥各個過程的功能基因，為癌癥治療提供更多有效途徑。Pan等[15]利用CRISPR/Cas9高通量篩選技術(shù)，使用Brie文庫，對表達Cas9的小鼠黑色素瘤BI6F10細胞進行篩選，結(jié)果顯示Pbrm1基因、Arid2基因以及Brd7基因有助于BI6F10細胞抵抗T細胞的殺傷力，而PBRM1基因失活可以使BI6F10細胞對T細胞產(chǎn)生的干擾素更敏感，增強T細胞介導(dǎo)的腫瘤攻擊反應(yīng)，該項研究成果為腫瘤免疫療法提供新靶點，有望使更多患者受益于免疫療法。B細胞受體現(xiàn)已成為B細胞淋巴瘤的治療靶點，依魯替尼藥物是一種BTK抑制劑，在用于患者治療中僅有部分人產(chǎn)生應(yīng)答，然而依魯替尼對具有CD79B基因突變和MYD88基因突變患者高度有效，為探究其中的原因，Phelan等[16]利用Brunello文庫對激活B細胞樣彌散大B細胞瘤細胞系進行遺傳性篩選，發(fā)現(xiàn)MYD88蛋白、TLR9蛋白和BCR蛋白形成了多蛋白復(fù)合體My-TBCR，該復(fù)合體可與mTOR共定位，激活NF-kB和mTOR通路，促進癌細胞存活，該研究為針對彌散性大B細胞瘤特定亞型設(shè)計藥物提供理論基礎(chǔ)。

近些年多項研究顯示，非編碼RNA在生物體各項生命活動中扮演重要角色，CRISPR/Cas9高通量篩選可以準確，有效用于非編碼RNA鑒定和功能分析中。2017年，Joung等[17]建立了靶向10 504個基因間IncRNA轉(zhuǎn)錄起始位點的sgRNA文庫，協(xié)同CRISPR SAM系統(tǒng)可用于研究IncRNA功能，之后他們以黑色素瘤細胞A375為模型篩選維洛非尼藥物抗性相關(guān)IncRNA，發(fā)現(xiàn)有11種IncRNA與細胞抗藥性相關(guān)，這為研究IncRNA功能以及鑒定新的IncRNA提供有效工具。2018年，Kurata等[18]建立了針對miRNA的sgRNA文庫，命名為LX-miR文庫，該文庫包含8 382個sgRNAs，可有效靶向85%已發(fā)現(xiàn)的miRNA，該文庫的建立使得miRNA鑒定更加便捷和準確，研究者利用該文庫篩選鑒定出影響Hela細胞和NCL-N87細胞生長的miRNA，該文庫為探究miRNA在耐藥性，病毒感染等其他方面功能提供有效平臺。

4 展望

近些年，CRISPR/Cas9技術(shù)受到眾多科研者的青睞，為基礎(chǔ)科學(xué)研究以及疾病治療帶來了更多的可能性。然而CRISPR/Cas9系統(tǒng)自身也存在一定局限性，例如脫靶效應(yīng)、遞送工具問題等。針對這些問題，科研人員就多方面不斷地探尋解決方法，例如使用納米材料遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)、改變sgRNA二級結(jié)構(gòu)、改變sgRNA的長度等，這些方法均對CRISPR/Cas9技術(shù)有明顯的改善作用[19-21]。與此同時，科研人員也致力于尋找新的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR/Cpf1是2015年張峰實驗組報道的新型CRISPR系統(tǒng)，該系統(tǒng)相比于CRISPR/Cas9系統(tǒng)更加簡單，近幾年也被陸續(xù)應(yīng)用于不同細胞及不生物體的基因組編輯，并且在某些生物體內(nèi)檢測到更低的脫靶效應(yīng),且該系統(tǒng)的出現(xiàn)擴展了CRISPR系統(tǒng)作用的靶基因位點范圍[22-23]。目前，已有多種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)被報道且科研人員不斷對系統(tǒng)進行優(yōu)化改進，相信未來多種CRISPR/Cas系統(tǒng)將一起更好的服務(wù)于科學(xué)研究和生命健康領(lǐng)域。